Главная страница MolBiol.ru > Методы > PCR > Влияние различных веществ на PCR Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Влияние различных веществ на PCR

Указаны значения, при которых присутствие этих веществ не сказывается на PCR.

    Красители

    Cresol red0.2mM
    Tetrazine dye yellow food coloring (Schilling Brand)1-2%
    Ксилен цианол<20µg/ml*
    Бромфеноловый синий<20µg/ml
    EtBr~ 0.1µg/ml

    * по другому источнику : 160 µg/ml.


    Вещества, улучшающие специфичность (и/или) выход PCR реакции

  • Важно отметить, что добавление этих веществ к уже оптимизированной и хорошо идущей реакции может вызвать ухудшение выхода. Это не удивительно - указанные вещества изменяют взаимодействие между праймерами и матрицей и между матрицей и полимеразой, и в случае хорошей реакции эти изменения скорее всего дадут отрицательный эффект.
  • Вещество:    Сток:   Используемые концентрации:Механизм действия:
    Acetamide25%~5%повышение растворимости
    Betaine Na5M0.5-2M
    (оптимально ~1.6M)
    стабилизация фермента, понижение Tm DNA, выравнивание Tm AT- и GC-богатых последовательностей
    BSA10 µg/ µl~0.1 µg/mlстабилизация фермента
    DMSO100%2.0-15%
    (оптимально ~5%)
    повышение растворимости
    Formamid100%1-5% 
    Glycerol100%5-20%
    (оптимально10-15%)
    стабилизация фермента
    NP-40, Tween 20, Triton X-10010%0.1-0.5%

    (улучшает seq. PCR)
    стабилизация фермента
    PEG 800040%5-20%
    (оптимально - 15%)
    повышение эффективной концентрации
    Tetramethylammonium chloride (TMA chloride)5M0.01-0.1mMповышение специфичности
    Pyrophosphatase thermostable5 u/µl0.001-1u/реакциюустранение пирофосфатов, которые могут обращать реакцию полимеризации
    ssDNA binding protein E.coli500 µg/ml5 µg/mlстабилизацияssDNA
    ssDNA binding protein T4 gene 32 protein500 µg/mlулучшает выход в концентрациях 0.5-1.0mM.стабилизация ssDNA
  • Из статьи "Kovarova M., Draber P. New specificity and yield enhancer of polymerase chain reactions. Nucleic Acids Res 2000 Jul 1;28(13):E70" В скобках – концентрация веществ, приводящая к указанному эффекту. Число перед скобками означает относительную эффективность действия. Специфичность оценивается как доля DNA, приходящаяся на специфическую полосу.
  • TMA производные практически не изменяли оптимальную температуру отжига.
  • Вещество Максимальная 90% ингибирование
    эффективностьспецифичность
    TMA chloride1.9(5 mM)0.5(20 mM)(35 mM)
    TMA oxalate2.2(2 mM)1.0(2 mM)(9 mM)
    TMA acetate1.0(<10 mM)0.4(20 mM)(40 mM)
    TMA hydrogen sulfate1.2(0.5 mM)1.0(50 mM)(70 mM)
    Ammonium chloride1.0(<20 mM)0.2(<20 mM)(50 mM)
    Benzyldimethylhexadecylammonium chloride1.1(0.2 mM)0.4(1 mM)(1.0 mM)
    HTA bromide1.2(0.05 mM)0.5(0.5 mM)(0.8 mM)
    HTA oxalate1.0(<0.2 mM)0.28(<0.2 mM)(0.5 mM)
    Betaine monohydrate1.1(100 mM)0.4(750 mM)(900 mM)
    Dimethyl sulfoxide1.0(<1.4 M)0.6(1.4 M)(1.6 M)
    Formamide1.4(0.5 M)0.8(1 M)(2.0 M)
    PCR без добавок1.00.2 



    Детергенты

    Неионные 
    NP-40>5% v/v
    Tween-20>5% v/v
    TritonX-100>5% v/v
    N-octylglucoside<0.4% w/v
    Ионныеотрицательный эффект до некоторой степени может быть скомпенсирован добавлением неионных детергентов
    SDS<0.01% w/v; 0.005% w/v снижает выход ~ в 2 раза;
    Na desoxycholate<0.06% w/v
    N-Lauroylsarcosine Na<0.02% w/v


    Другие вещества

    Агарозане мешает до ~1%.
    АА акриламид линейныйне мешает (по крайней мере в низкой концентрации).
    AcONa (pH 5.0)начинает ингибировать при>5mM.
    BSA ацетилированный10µg/ml - ингибирует.
    BSA heat инактивированный10µg/ml - не мешает.
    Vanadil ribonucleoprotein complexesингибируют при > 0.4mM; не мешают при <0.04mM (когда цвет 8-гидроксихинолина в феноле не изменяется при экстракции - уже не ингибируют)
    Гемоглобин (концентрация в крови ~160mg/ml)уменьшает выход при >1mg/ml.
    Гепаринингибирует (используется для предотвращения свертывания крови 14.3 u/ml, не устраняется органическими растворителями и переосаждением).
    Ингибирует PCR при >0.15U/ml.
    EDTAсвязывается с Mg2+ стехиометрически, начинает ингибировать при >0.5mM, PCR не идёт при 1mM.
    DEPCингибирует реакцию, лучше не использовать в PCR-реакции растворы, обработанные DEPC.
    Желатин10µg/ml - не мешает.
    Изопропанолингибирование при концентрациях >1% (более сильный ингибитор, чем этанол).
    Масло, покрывающее PCRможет устранять ингибирующий эффект некоторых загрязнений.
    Мочевина (в моче ~350mM)на разные реакции - по разному, в среднем, начинает ингибировать при >20mM.
    NaClзаметно ингибирует при 25mM, PCR не идёт при 50mM.
    RT смесьне влияет на PCR реакцию при концентрации 10%, начинает ингибировать при >15%.
    RNAингибируют (>0.5µg на 20µl PCR); ингибирующий эффект можно устранить добавлением в реакцию RNase (термостабильна).
    Сахарозане мешает до 30%.
    Фенолуменьшает выход при >0.2%, PCR не идёт при 0.5%.
    Ficoll 400не мешает до 1% (выше - ингибирует).
    HxPO4Mg3(PO4)2 - образует преципитат при NT, если >0.25mM (в PBS - HxPO4~9.3mM).
    Этанолдля некоторых реакций - стимулирующий эффект при 1%, для других - ингибирование при концентрациях >1%.
    Хлороформне влияет на PCR реакцию даже при концентрации 5%.
    Цитрат Naне оказывает влияния при 1mM.
    МеланинЗаметно от 0.01µg/µl, ингибирует: 0.08µg/µl.
    Polyvinilpyrollidon (PVP)не ингибирует по крайней мере до 2%
    Мембраны:
    Nitrocelluloseингибирует PCR
    Cellulose acetateингибируетPCR
    Fluroporeне ингибирует PCR
    Duraporeне ингибирует PCR


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 24568


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


    Дополнения, комментарии, вопросы

    Цыгира /28.02.2006 16:54/
    Опечатка
    BSA 10 µg/ µl ~0.1 µg/ml стабилизация фермента
    надо
    BSA 10 µg/ µl ~0.1 µg/µl стабилизация фермента



    гость: G /28.02.2006 18:01/
    BSA 10 µg/ µl - стабилизация фермента? Не многовато BSA?



    Гость /16.11.2006 12:48/
    HELP!
    Уважаемые коллеги! У меня проблема. Для сиквенса 16s ставила ПЦР с праймерами f27-r1392 и f530-r1525. Получала толстый фрагмент, но под ним шла паразитная полоска с низкой концентрацией в каждом случае. Элюировала толстую полосу из геля и ставила ре-ПЦР с теми же праймерами и еще с внутренними: с матрицы f27-r1392 ставила с праймерами 40-1392, 357-1392, с матрицы f530-r1525 с праймерами 530-1492. Во всех случаях та же самая история - идет дополнительная полоса. Вряд ли это внутреннее праймирование, но я боюсь, что при сиквенсе будет ерунда. Насколько плачевна моя ситуация? Может, я гоню волну?
    Заранее благодарна за ответ.



    Guest /17.11.2006 12:26/
    Цыгира - такая концентрация БСА - это в стеклянных капиллярах на Lightcycler smile.gif



    Guest /17.11.2006 12:32/
    цигира - почитай эту статейку smile.gif
    1: Anal Biochem. 1990 May 1;186(2):328-31. Links
    Minimizing the time required for DNA amplification by efficient heat transfer to small samples.

    * Wittwer CT,
    * Fillmore GC,
    * Garling DJ.

    Department of Pathology, University of Utah Medical School, Salt Lake City 84132.

    Hot-air temperature cycling of 1- to 10-microliters samples in glass capillary tubes can amplify DNA by the polymerase chain reaction in 15 min or less. A rapid temperature cycler of low thermal mass was constructed to change sample temperatures among denaturation, annealing, and elongation segments in a few seconds. After 30 cycles of 30 s each, a 536-bp beta-globin fragment of human genomic DNA was easily visualized with ethidium bromide on agarose gels. With rapid cycling, amplification yield depended on polymerase concentration. The time required for DNA amplification can be markedly reduced from prevailing protocols if appropriate equipment and sample containers are used for rapid heat transfer to the sample.

    PMID: 2363506 [PubMed - indexed for MEDLINE]



    Sveta Tim /28.02.2007 18:37/
    Пожалуйста, подскажите. Концентрацию ДНК, выделенной из крови с гепарином, увеличить или уменьшить, если при нормальной концентрации не идут реакции?



    Guest /28.02.2007 21:11/
    Разбавлять до бесконечности с кратностью два раза - кто кого победит, ингибирующее влияние гепарина на ПЦР или количество матрицы в среде. Потом расскажете на форуме и ПЦР-ный мир отблагодарит Вас.



    Solaris /01.03.2007 18:41/
    Еще одно вещество, повышающее эффективность PCR, - 2-пирролидон. Рабочая концентрация - 3%.



    Гость /14.03.2008 17:41/
    Привет! как избавиться от неспецифики при ПЦР??? Что только уже не пробовала? Подскажите!Заранее спасибо!



    Ъ /14.03.2008 18:01/
    (Гость @ 14.03.2008 16:41)
    Ссылка на исходное сообщение  Привет! как избавиться от неспецифики при ПЦР??? Что только уже не пробовала? Подскажите!Заранее спасибо!

    Правильно выбранные праймеры работают без неспецифики даже бе хотстарта и волшебных добавок. umnik.gif Праймеры в студию и "чистосердечные признания"! yes.gif



    Guest /14.03.2008 18:11/
    (Ъ @ 14.03.2008 17:01)
    Ссылка на исходное сообщение  Правильно выбранные праймеры работают без неспецифики даже бе хотстарта и волшебных добавок. umnik.gif  Праймеры в студию и "чистосердечные признания"! yes.gif

    smile.gif а иначе -расстрел на месте smile.gif без последнего "Прощай" smile.gif



    Ъ /14.03.2008 18:19/
    (Гость @ 14.03.2008 16:41)
    Ссылка на исходное сообщение  Привет! как избавиться от неспецифики при ПЦР??? Что только уже не пробовала? Подскажите!Заранее спасибо!

    Вина красного сухого пробовали? Советую не более двух бокалов. umnik.gif Это у меня такие тяпничные советы как ПЦР улучшить. lol.gif lol.gif beer.gif beer.gif



    Guest /14.03.2008 18:23/
    (Ъ @ 14.03.2008 17:19)
    Ссылка на исходное сообщение  Вина красного сухого пробовали? Советую не более двух бокалов. umnik.gif  Это у меня такие тяпничные советы как ПЦР улучшить. lol.gif  lol.gif  beer.gif  beer.gif

    А у тебя что - уже рабочий день закончился ? smile.gif



    Ъ /14.03.2008 18:30/
    (Guest @ 14.03.2008 17:23)
    Ссылка на исходное сообщение  А у тебя что - уже рабочий день закончился ?  smile.gif

    А что, хочешь предложить сообразить на троих? smile.gif Конечному продукту только дай знак - всегда готов.



    Гость /05.06.2008 07:22/
    а как развести DEPC если есть раствор 1 мл (Медиген) а конц не известна? плиз



    Ъ /05.06.2008 10:03/
    (Гость @ 05.06.2008 06:22)
    Ссылка на исходное сообщение  а как развести DEPC если есть раствор 1 мл (Медиген) а конц не известна? плиз

    Сначала в этаноле, 1 или 10%. После растворения в воде, автоклавировать. Следовые количества DEPC сильно ингибируют RT и PCR.



    Гость /08.08.2008 09:08/
    Kuzminka: Люди добрые, подскажите, почти целый год бьюсь над ПЦР-слабая наработка (еле видимая)продукта амплификации. Что делать?



    Гость /08.08.2008 09:15/
    Кuzminka :'( : кто-нибудь когда-нибудь пользовался набором для выделения ДНК, а именно: Genomic DNA Purification Kit K0512 фирмы "Fermentas"? Проблема: после добавления преципитационного раствора к р-ру, содержащему ДНК и после центрифугир-я должен образоваться супернатант, но его мы не видим, мы чо слепые или чо??? Заранее спасибо за помощь! :)



    Guest /08.08.2008 10:21/
    (Гость @ 08.08.2008 08:15)
    Ссылка на исходное сообщение  Кuzminka :'( : кто-нибудь когда-нибудь пользовался набором для выделения ДНК, а именно: Genomic DNA Purification Kit K0512 фирмы "Fermentas"? Проблема: после добавления преципитационного раствора к р-ру, содержащему ДНК и после центрифугир-я должен образоваться супернатант, но его мы не видим, мы чо слепые или чо??? Заранее спасибо за помощь! smile.gif

    Т.е. хотите сказать, что не видите преципитат (осадок с ДНК)? А супернатант не видеть невозможно, даже если он прозрачный и бесцветный! no.gif.



    Guest /11.08.2008 12:09/
    там, видимо, какой-то специфический днк-содержащий супернатант должен быть



    Guest /11.08.2008 13:49/
    (Guest @ 11.08.2008 11:09)
    Ссылка на исходное сообщение  там, видимо, какой-то специфический днк-содержащий супернатант должен быть

    Если это после хлороформа, да. А если после "преципитационного раствора", нет:
    http://www.fermentas.com/profiles/kits/pdf/coa_k0512.pdf ( http://www.fermentas.com/profiles/kits/pdf/coa_k0512.pdf )



    Гость /12.08.2008 12:38/
    Kuzminka: да, в том то и дело, что там должен образоваться осадок ДНК, но я его не вижу. В чем причина?



    Guest /12.08.2008 13:38/
    (Гость @ 12.08.2008 11:38)
    Ссылка на исходное сообщение  Kuzminka: да, в том то и дело, что там должен образоваться осадок ДНК, но я его не вижу. В чем причина?

    Если Вы хотите увидеть осадок геномной ДНК из 200 мкл крови, то зря стараетесь. no.gif
    Не ищите преципитат ДНК, а делайте все по протоколу до конца. umnik.gif
    Угораздило же Вас купить неудобный набор для выделения ДНК из микрообъема крови. confused.gif no.gif
    Это протокол удобен при выделении ДНК из больших объемов, более 1 мл крови.



    Гость /14.08.2008 12:54/
    Kuzminka: спасибо,конечно, за хорошие советы, но я работаю с растительным геномом. Как быть в этом случае? Заранее благодарю!



    Yuri K /14.08.2008 15:58/
    Just add carrier for precipitation, like MB-grade glycogen, and forget about it.



    Гость /15.08.2008 09:00/
    What is "MB-grade glyconen"? Translate in Russia, please!



    Гость /15.08.2008 09:05/
    What is "MB-grade glyconen"? Translate in Russian, please!



    Guest /15.08.2008 09:44/
    (Гость @ 15.08.2008 08:05)
    Ссылка на исходное сообщение  What is "MB-grade glyconen"? Translate in Russian, please!

    Гликоген для мол.биол. Специальный, для соосаждения ДНК и РНК, без ДНК-аз и РНК-аз.



    Yuri K /15.08.2008 16:08/
    GlycoGen, sorry for the typo.



    Гость /18.08.2008 07:24/
    Kuzminka: Thanks! А ск-ко вешать в граммах? Т.е.сколько его необходимо добавлять7 Заранее благодарю!



    Yuri K /18.08.2008 15:50/
    (Гость @ 18.08.2008 06:24)
    Ссылка на исходное сообщение  Kuzminka: Thanks! А ск-ко вешать в граммах? Т.е.сколько его необходимо добавлять7 Заранее благодарю!

    With glycogen from IVGN (SKU# 10814-010) which is 20 ug/uL, just add 1 uL per Eppendorf (i e, 0.5-1.5 mL final volume) precipitation.

    Tip: Make sure you vortex your DNA solution after you added glycogen.



    metrim /28.04.2015 00:39/
    А есть ли какие то компоненты или факторы могут влиять на "посадку праймера" на матрицу?
    То что приведено - влияет скорее на функционирование полимеразы, а что может оказывать влияние, мешать комплиментарному связыванию праймера с матрицей, искажать процесс?



    Guest /29.04.2015 13:32/
    ПЦРу очень помогают crowding агенты - типа трегалозы, высокомолекулярных ПЭГов.
    из недавнего замечено, что RecA белочек тоже помогает убрать неспецифику.
    а в обсчем - удачные праймеры, оптимальный буфер и полимераза (или смесь) творят чудеса...








       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler