Главная страница MolBiol.ru > Методы > PCR > Устранение загрязнений Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Борьба с загрязнениями при PCR


Алексей Солдатов
Андрей Попов /ВИЖ, Дубровицы/


    Наиболее распространённый способ - UV облучение

  • Чувствительность к облучению различных компонентов PCR-реакции:
  • dNTP'sпрактически нечувствительны
    Primer'sзаметно чувствительны (зависит от последовательности и концентрации)
    Taq polвесьма чувствительна (5u/µl Taq pol теряет 50% активности за 6' облучения на Stratalinker)
  • dNTP's сильно поглощают UV. Если проводить облучение PCR-mix без dNTP's, то для достижения того же эффекта требуется ~ в 30 раз меньшее время облучения.
  • Облучение лучше проводить в растворе, так как сухая DNA в ~5x103 раз менее чувствительна к облучению, чем влажная.
  • Механизм инактивации DNA не очень понятен, так как эффективность инактивации не коррелирует ни с количеством пиримидиновых димеров, ни с длиной фланкирующей DNA (межцепочечные сшивки). Присутствие EtBr также не влияет на эффективность инактивации.
  • Облучение ~5' на Stratalinker приводит к падению эффективности PCR на 750bp фрагменте в ~106 раз. Интенсивность облучения практически линейно падает с увеличением расстояния от ламп Stratalinker.
  • Длинные фрагменты DNA более чувствительны, чем короткие. Чувствительность довольно резко растёт до ~700bp, затем скорость роста снижается.

    Относительная чувствительность:

    209bp1
    551bp125
    2277bp1000


    Использование урацил ДНК гликозилазы

     Впервые описано в статье "Longo MC, Berninger MS, Hartley JL. Gene 1990 93, 125 Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions".

    Загрязнение предотвращается либо заменой dTTP на dUTP, либо введением урацила в праймеры (со вторым способом надо быть осторожнее - некоторые праймеры якобы содержащие урацил до конца не расщепляются - об этом ниже). При этом в пре-ПЦР процедуры вводится урацил ДНК гликозилаза (UDG). Этот фермент отщепляет основания урацила от сахарофосфатного остова но не действует на dUTP. Апиримидиновые сайты блокируют работу полимеразы и легко разваливаются при нагревании.


    От Тани:

    Возилась на днях с Uracil DNA Glycosylase (UDG). Этот фермент вырезает уридины из ДНК, образуя abasic сайты, которые рушатся при нагревании. Сначала проверила, как она щепит праймер с двумя U в середине. Получил вот такую картинку: сначала идут двукратные разведения UDG (Sigma #U1257) начиная с 0.5u на дорожку, на последней дорожке исходный праймер. На реакцию (10µl) брал 5pmol меченого праймера. Условия: 37oC - 15', 95oC - 15'. Выходит, что UDG работает при совсем небольших концентрациях, а еще, видимо, в праймер при синтезе вставляют смесь U c T, так как на всех дорожках что-то остается.

    Потом, для работы мне нужно было знать, когда начинают валится abasic сайты, поэтому после обработки UDG я держал реакцию на 95oC от 1 до 20 минут. Тоже есть на что посмотреть.





    Загрязнение поверхностей

    Устраняются 1' обработкой гипохлоридом Na.


    От Андрея Попова /ВИЖ, Дубровицы/

    • ПЦР и электрофорез проводить в разных комнатах;
    • работать по-возможности под ламинаром с приточной вентиляцией (в лицо);
    • перед приготовлением ПЦР-смеси, протереть ладони и край стола абсолютным спиртом (я бы предпочёл какой-нибудь водный раствор: нам надо смыть ДНК, а она в спирте не растворяется /прим. Редактора/);
    • входя в электрофорезную, одевать специальный халат, после постановки электрофореза – мыть руки с мылом; уходя, снимать спецхалат;
    • если вы сегодня делали электрофорез, не начинайте готовить новую ПЦР.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 17960

    Дополнения, комментарии, вопросы

    _Алишер_ /11.01.2006 03:02/
    Сэмплеры (пипетманы)желательно периодически разбирать и промывать, работать в перчатках, не усатраивать сквозняки



    Гость /11.01.2006 03:52/
    Это к сообщению Андрея Попова из Дубровиц

    С чем связано мистическое указание не готовить новую ПЦР, если сегодня гнали форез? Может быть, с фазами луны?



    _Cold2_ /11.01.2006 03:56/
    По поводу Uracil DNA Glycosylase. Фермент хороший. Но с ним надо быть осторожней. Фермент стоек инактивированию нагреванием. Поэтому надо точно подобрать концентрацию(активность), иначе по ходу амплификаци бидет идти и деградация. А продукты деградации при денатурации превращаются в "праймеры". И вместо ожидаемого продукта получается сплошной шмер. Данное явление можно наблюдать при работе с некоторыми наборами фирмы "Амплисенс"



    _poanik_ /11.01.2006 03:58/
    (Гость @ 11.01.2006 02:52)
    Ссылка на исходное сообщение  Это к сообщению Андрея Попова из Дубровиц

    С чем связано мистическое указание не готовить новую ПЦР, если сегодня гнали форез? Может быть, с фазами луны?

    Всё просто: на одежде, руках, подошвах обуви и т.д. могут остаться продукты ПЦР. Поэтому лучше перестраховаться, чем потом искать источник контаминации.



    Гостинец 1 /11.01.2006 14:50/
    Ага. Надеть, забинтовать, снова надеть, снова забинтовать, три раза повторить, и ни в коем случае...



    Carbon Copy /11.01.2006 19:43/
    Мдя... Вы, ребята внесли весомый вклад в развитие литературных жанров городского фольклора и научных баек. Можно, конечно, иногда поприкалываться, но, не до такой же степени! Все эти истории с летающими ампликонами уже надоели хуже горькой редьки. Нужно все-таки знать меру и критически оценивать действительность.

    Если быть серьезным, то, чаще всего устранение загрязнений PCR проще и надежнее всего достигается устранением вполне конкретных и определенных личностей, эти загрязнения регулярно привносящих. В отсутствии подобных субъективно-личностных факторов загрязнение PCR, если таковое имеет место быть, устраняется соблюдением элементарных правил, никак не отраженных в материале, любезно предоставленном Алексеем и Андреем, а именно:

    1. Никогда не использовать никакой расходный пластик вторично!
    2. Использовать только filter tips (носики с фильтрами).
    3. Хранить расходный пластик в герметично закрытых банках/коробках.
    4. Не лапать никакой расходный пластик руками, доставать из банки/коробки только пинцетом.
    5. Всегда следовать золотому правилу молекулярной биологии: один носик – одно пипетирование!
    6. Аккуратно открывать PCR пробирки/стрипы/плашки, предотвращая разбрызгивание, для чего их достаточно немного открутить.
    7. После применения собирать весь расходный пластик в полиетиленовые пакеты и сразу же выбрасывать.
    8. Аликвотить реактивы и растворы небольшими порциями, хранить запасы и реактивы используемые в настоящий момент отдельно.
    9. При подозрении на загрязнение реактивов безжалостно выбрасывать все компоненты, использованные в реакции, и начинать с новых аликвот/упаковок.

    Желаю успехов!



    бутанол /14.01.2006 11:04/
    я б добавил о необходимости обработки пинцетов, и более трепетного отношения к таре с носиками (а то забавно смотрятся коллеги выколупывающие носики грязным пинцетом из старой стеклянной банки используемой лет 5 подряд путем добавления в нее новых носиков).



    genseq /15.01.2006 09:59/
    Основные загрязнители почему-то пропущены. Это форез. И гели, и буфер содержат огромное количество ампликонов. На электродах выделяются пузырьки кислорода и водорода, которые лопаются на поверхности буфера и дают мельчайший аэрозоль, загрязняющий всё помещение.



    Carbon Copy /15.01.2006 19:44/
    (genseq @ 15.01.2006 06:59)
    Ссылка на исходное сообщение  Основные загрязнители почему-то пропущены. Это форез. И гели, и буфер содержат огромное количество ампликонов. На электродах выделяются пузырьки кислорода и водорода, которые лопаются на поверхности буфера и дают мельчайший аэрозоль, загрязняющий всё помещение.

    Вы это серьезно? Это ж какая концентрация ампликонов должна быть в буфере, чтобы форезным аэрозолем загрязнить все помещение? IMHO это - одна из живучих научных легенд, передаваемых из уст в уста лаборантами/ студентами/ аспирантами и используемых для оправдания элементарной криворукости и неаккуратности. Посудите сами, чтобы ампликоны оказались в буфере, необходимо как минимум, чтобы предыдущий форез убежал и чтобы Вы использовали этот буфер вторично. Как часто это с Вами случается? К тому же давно прошли времена, когда форезные ванночки клеили сами эпоксидкой, все давно гоняют форезы в закрытых аппаратах с крышкой.



    Гость /24.08.2006 23:24/
    боже, как все запущеноо.....



    guest: Гость /04.11.2007 08:02/
    "ИМХО это - одна из живучих научных легенд, передаваемых из уст в уста лаборантами/ студентами/ аспирантами и используемых для оправдания элементарной криворукости и неаккуратности. "

    Согласна!!!! Особенно это легенда распростроняется в диагностических лабораториях... где ничего нормално не организовано, фиг знает какие реактивы, но виноваты исклучително ампликоны :lol:



    Лиснигнах /04.11.2007 08:56/
    1. Типсы не стоит держать навалом в банках - есть коробки 96-дырочного формата. Тогда необходимость лапать их хоть руками, хоть пинцетом отпадает в принципе - достаточно ткнуть пипеткой.

    2. Поделить лабу на преПЦР и постПЦР зоны, пипетки, коробки с типсами и перчатки туда-сюда не таскать.

    3. Пробирки/плашки движутся строго в одном направлении: преПЦР-постПЦР-мусорка. Сиквенсы и т.п. месить на постПЦР зоне. Плашки, заклеенные липкой пленкой, открывать особенно аккуратно - лучше либо в замороженном состоянии, либо сразу после амплификатора (с горячих плашек отстает хорошо) - иначе недолго уделать все и вся вокруг.

    4. За нарушения регламента бить морду.



    guest: Гость /04.11.2007 13:05/
    Интересно... А у нас все в однои комнате и все хорошо проходит. Просто делать надо руками, а не...



    Yuri K /05.11.2007 03:31/
    Always work only in closed format! FRET rules! smile.gif



    Guest /05.11.2007 11:13/
    (Yuri K @ 05.11.2007 03:31)
    Ссылка на исходное сообщение  Алщаыс щорк онлы ин цлосед формат! ФРЕТ рулес! smile.gif

    Юр - гелъ ставь - полосочки вырезай - клонируй - сиквенируй - ВНУТРИ ЗАКРЫТОЙ
    ПРОБИРКИ smile.gif Ну так прям тебя и представил внутри еппендорфа 0.5 мл smile.gif
    как ты в пробирке копашишся smile.gif



    Yuri K /05.11.2007 18:04/
    (Guest @ 05.11.2007 11:13)
    Ссылка на исходное сообщение  Юр - гелъ ставь - полосочки вырезай - клонируй - сиквенируй - ВНУТРИ ЗАКРЫТОЙ
    ПРОБИРКИ  smile.gif Ну так прям тебя и представил внутри еппендорфа 0.5 мл  smile.gif
    как ты в пробирке  копашишся  smile.gif

    If you can't work in closed format, you need to burn your lab to the ground after each gel you run.

    (Just kidding)

    The problem of contamination in PCR is not really a scientific problem; it is a problem of poorly trained and/or underpaid personel working in high tech environment.



    Ъ /06.11.2007 01:09/
    Все подвиги, когда все в одной комнате и одной пипеткой (ужас), это до первой контаминации.
    Важно не соблюдение целого ряда (на всю страницу) антиконтаминационных мер, а понимание откуда происходит ЭТО. umnik.gif Меры у вас автоматически сами появятся.



    ChainiK /07.11.2007 04:22/
    Q: Ну и ещё один "гемморой" как вопрос "что есть сток", а именно, нужно ли чистить ПЦР продукт (длинный кусок 16S rDNA) перед ре-ампилификацией... что скажут корифеи? (слышал версий много - аж 3, придерживаюсь одной)



    Guest /07.11.2007 14:05/
    (Yuri K @ 05.11.2007 18:04)
    Ссылка на исходное сообщение  Иф ёу цаньт щорк ин цлосед формат, ёу неед то бурн ёур лаб то тхе гроунд афтер еач гел ёу рун.

    (Юст киддинг)

    Тхе проблем оф цонтаминатион ин ПЦР ис нот реаллы а сциентифиц проблем; ит ис а проблем оф поорлы траинед андор ундерпаид персонел щоркинг ин хигх теч енвиронмент.

    Кстати - могу безплатную рекламу для праймер компаний smile.gif
    "Суицид ПЦР" umnik.gif Самая крутая ПЦР в мире umnik.gif
    В основе - ОДНОРАЗОВЫЕ ПРАЙМЕРЫ - сделал ПЦР с одной парой на чуму- "Черная Смерть" - след ПЦР с НОВОЙ парой праймеров чтоб без КОНТАМИНАЦИИ smile.gif
    http://www.pnas.org/cgi/content/full/97/23/12800 ( http://www.pnas.org/cgi/content/full/97/23/12800 )



    Yuri K /07.11.2007 16:28/
    (ChainiK @ 07.11.2007 04:22)
    Ссылка на исходное сообщение  Q: Ну и ещё один "гемморой" как вопрос "что есть сток", а именно, нужно ли чистить ПЦР продукт (длинный кусок 16S rDNA) перед ре-ампилификацией... что скажут корифеи? (слышал версий много - аж 3, придерживаюсь одной)

    No. Just dilute it.



    Yuri K /07.11.2007 16:33/
    (Guest @ 07.11.2007 14:05)
    Ссылка на исходное сообщение  Кстати - могу безплатную рекламу для праймер компаний  smile.gif
    "Суицид ПЦР"  umnik.gif  Самая крутая ПЦР в мире  umnik.gif
    В основе - ОДНОРАЗОВЫЕ ПРАЙМЕРЫ - сделал ПЦР с одной парой на чуму- "Черная Смерть" - след ПЦР с НОВОЙ парой праймеров чтоб без КОНТАМИНАЦИИ  smile.gif
    http://www.pnas.org/cgi/content/full/97/23/12800 ( http://www.pnas.org/cgi/content/full/97/23/12800 )

    I'm not sure I would rely on a system that lacks positive control ;-))



    Guest /07.11.2007 17:58/
    (Yuri K @ 07.11.2007 16:33)
    Ссылка на исходное сообщение  Иьм нот суре И щоулд релы он а сыстем тхат лацкс поситиве цонтрол ;-))

    lol.gif lol.gif lol.gif в чем проблема ? - в америке добровольцы-бойскауты повывелись?



    Guest /09.03.2008 12:14/
    А всякие там "PCR cabinet", с ламинарным потоком воздуха, фильтами (ну, разумеется, не ПЦР-продукты, но частицы задерживающими) и УФ - это совсем "лажа"? shuffle.gif
    Имеется в виду, разумеется, ситуация, когда из раза в раз используется один и тот же "набор" праймеров - и перейти временно на другие ( как, собственно, и проще всего решить проблему в случае загрязнения) не предствляется возможным - по всяким ненаучным соображениям ( вроде GMP документации и т.п. frown.gif ).



    Guest /09.03.2008 21:33/
    Начинайте пользоваться dUTP и UDG. Для Вашего случая это много эффективнее чем лам. бокс. Да и подешевле



    Guest /10.03.2008 21:03/
    (Guest @ 09.03.2008 20:33)
    Ссылка на исходное сообщение  Начинайте пользоваться dUTP и UDG. Для Вашего случая это много эффективнее чем лам. бокс. Да и подешевле
    - конечно, попробовали. Один из восьми регулярно тестируемых в панели "обязательных" амплифицируется значительно хуже уже при переходе на Hotstar, а с dUTP ( в т.ч. и с повышенной концентрацией) практически не виден frown.gif . Не скажу, чтобы меня донимали и раньше загрязнения - пока не наблюдались, но "от греха подальше " и чтобы ублажить инспекции smile.gif , раз так рекомендуют, стал работать в этом "скворечнике". Хуже точно не стало - но лучше ли? ведь проблему, вопреки классику жанра, решил "до ее поступления" smile.gif . Потому и спросил - может, есть такие, что без "ПЦР кабинета" бедствовали", а с ним круто изменилась жизнь? smile.gif



    Гость /15.10.2008 12:04/
    срочно нужно освоить пцр,в какой-нибудь лаборатории возможно это сделать за деньги на примере E.coli?????????????



    Guest /07.09.2010 07:59/
    ага.confused.gif....все конечно правильно и замечательно, но как бороться с теми, кто считает что ПЦР-ить можно в комнате с электрофорезом, обратной транскрипцией и до кучи с ИФА-методиками ( кстати тут об этом ничего не написано ) а если в преПЦР-ной мойка? а если холодильник для реактивов один на всех и все? что делать? mad.gif
    по поводу УФ - я "освещаю" перед работой все кроме полимеразы и праймеров. минут по 3-4. не знаю правильно или нет. tongue.gif



    -Ъ- /07.09.2010 09:57/
    (Guest @ 07.09.2010 08:59)
    Ссылка на исходное сообщение  ага.confused.gif....все конечно правильно и замечательно, но как бороться с теми, кто считает что ПЦР-ить можно в комнате с электрофорезом, обратной транскрипцией и до кучи с ИФА-методиками ( кстати тут об этом ничего не написано ) а если в преПЦР-ной мойка? а если холодильник для реактивов один на всех и все? что делать? mad.gif
    по поводу УФ -  я "освещаю" перед работой все кроме полимеразы и праймеров. минут по 3-4. не знаю правильно или нет.    tongue.gif

    Мадонна, "освещать все" УФ 3-4 мин - это поцелуи через стекло. no.gif



    RJ Dio /07.09.2010 11:28/
    (Лиснигнах @ 04.11.2007 09:56)
    Ссылка на исходное сообщение  1. Типсы не стоит держать навалом в банках - есть коробки 96-дырочного формата. Тогда необходимость лапать их хоть руками, хоть пинцетом отпадает в принципе - достаточно ткнуть пипеткой.

    2. Поделить лабу на преПЦР и постПЦР зоны, пипетки, коробки с типсами и перчатки туда-сюда не таскать.

    3. Пробирки/плашки движутся строго в одном направлении: преПЦР-постПЦР-мусорка. Сиквенсы и т.п. месить на постПЦР зоне. Плашки, заклеенные липкой пленкой, открывать особенно аккуратно - лучше либо в замороженном состоянии, либо сразу после амплификатора (с горячих плашек отстает хорошо) - иначе недолго уделать все и вся вокруг.

    4. За нарушения регламента бить морду.

    к последнему тезису особо присоединяюсь. Все верно. Если кто сомневается- до первого засора и полной дезактивации помещения (если. конечно. задача того требует).



    Guest /09.09.2010 09:28/
    (RJ Dio @ 07.09.2010 11:28)
    Ссылка на исходное сообщение  к последнему тезису особо присоединяюсь. Все верно. Если кто сомневается- до первого засора и полной дезактивации помещения (если. конечно. задача того требует).

    по тридцать-сорок. на клавиатуре оторвали ноль. гады.



    -Ъ- /09.09.2010 09:34/
    (Guest @ 09.09.2010 10:28)
    Ссылка на исходное сообщение  по тридцать-сорок. на клавиатуре оторвали ноль. гады.

    А по 30-40 мин - это уже долгий поцелуй,... возможно с засосом smile.gif , но опять же - через стекло.
    Бесполезно. frown.gif только воздух обеззараживаете и насыщаете всякими вредными радикалами.



    VVolkov /09.09.2010 13:09/
    Какой ужОСС. Я в начало заглянул. smile.gif Там же с начала смотреть не на что. Картинки ужасные. А зачем при PCR облучать ультрафиолетом и что облучать? Заново все переписывать нужно.

    Борьба с загрязнениями при PCR
    UV облучение
    Урацил ДНК гликозилаза
    Загрязнение поверхностей
    Дополнить


    Алексей Солдатов
    Андрей Попов /ВИЖ, Дубровицы/



    Наиболее распространённый способ - UV облучение



    VVolkov /09.09.2010 17:48/
    Как основоположников - в архив и на постамент! Как все начиналось. smile.gif Только пыль стирать аккуратно мягкой тряпочкой. smile.gif








       


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler