Главная страница MolBiol.ru > Методы > PCR > Очистка PCR продуктов Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Очистка PCR продуктов на silica spin колонках

Тот же протокол можно использовать для очистки DNA после (или между) ферментативных реакций.
     ДНК снимается с мембраны в низкосолевом буфере, совместимым с большинством дальнейших применений.
  1. добавить к PCR-смеси 4х кратный объём буфера AB (минеральное масло можно не убирать);
  2. тщательно смешать и нанести на колонку (ЦФ 1 – 2');
  3. промыть колонку 400µl PB4 (ЦФ 0.5 – 1');
  4. дважды промыть колонку 400µl WB;
  5. убрать элюат из 2ml пробирки-резервуара и высушить колонку ЦФ 2';

  6. элюция DNA:
  7. поместить колонку в чистую 1.5ml микроцентрифужную пробирку;
  8. нанести на колонку ~30µl EB, инкубировать >1';
  9. центрифугировать 2'.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 12560

    Растворы

    AB (adsorbtion buffer)

    (хранить при 4oС):
    Guanidine isothiocianate = GuSCN

    Конц.Сток10.0ml50.0ml
    GuSCN5M118.16g/M5.91g29.54g
    MES, pH 5.550mM1M0.5ml2.5ml
    EDTA, pH8.020mM0.5M0.4ml2.0ml
    Triton X-1000.5%10%0.5ml2.5ml
    Cresol red0.05mM50mM10µl50µl
    H2O mQ4.09ml20.45ml

    PB4

    (хранить при 4oС):
    Guanidine isothiocianate = GuSCN

    Конц.Сток10.0ml50.0ml
    GuSCN5M118.16g/M5.91g29.54g
    EDTA0.1M0.5M2.0ml10.0ml
    H2O mQ3.5ml17.5ml

    MES, pH 5.5, 1M

    (хранить при 4oС):

    Конц.Сток10.0ml50.0ml
    MES (Na)1M217.2g/M2.17g10.86ml
    Укс. к-та (лед.)853mM17.4M0.49ml2.45ml
    H2O mQ   

    WB

    (хранить при NT):

    Конц.Сток10.0ml50.0ml
    Этанол80%100%8.0ml40.0ml
    TrisCl, pH7.510mM1M0.1ml0.5ml
    H2O mQ1.9ml9.5ml

    EB

    (хранить при 4oС):

    Конц.Сток10.0ml50.0ml
    TrisCl, pH8.510mM1M0.1ml0.5ml
    H2O mQ9.9ml49.5ml


      Комментарии

      Общие

    • Изготовление silica spin колонок описывается в протоколе "Очистка pDNA на silica spin колонках". Там же описаны проблемы, которые может вызвать очистка на стеклянных мембранах (ингибирование некоторых ферментов).
    • Все промывки можно проводить не только на центрифуге, но и с помощью вакуумной промывалки.
    • Принцип метода: ДНК обратимо сорбируется на поверхность стеклянной мембраны в растворе с высокой концентрацией хаотропной соли, примеси отмываются хаотропной солью и 80% этанолом, и очищенная DNA элюируется в буфере с низкой ионной силой (годится для сиквенса и практически всех других применений).
           От состава и объёма преципитационного буфера зависит, какая именно ДНК (размер, состояние) преципитируется на стекло. На верхнем рисунке показана очистка маркеров молекулярного веса при использовании 5 объёмов буфера AB или одного объёма буфера NIB:isopropanol = [1:1] [NIB: 6.6M NaI, 16mM Na2SO3, 0.05mM Cresol Red (хранить в темноте при 4oC)]. Плохая преципитация коротких фрагментов часто даже выгодна, так как позволяет избавиться от праймеров и праймер-димеров. Изменяя состав буфера можно добиться даже селективной преципитации двух- или одноцепочечной ДНК (см. "Разделение смеси одноцепочечной и двухцепочечной DNA на silica spin колонках")
           Нижний рисунок - очистка 20µl ПЦР-смеси на 1хGF/F колонках с помощью различных преципитационных буферов. Контроль (без очистки) отмечен звёздочкой. Объём преципитационного буфера указан над дорожками. Буфара: 10M LiCl:isopropanol=[1:1] (LiCl); 5M NaCl:isopropanol=[1:1] (NaCl); AB:isopropanol=[1:1] (AB); NIB:isopropanol=[1:1] (NIB). Таким образом, смесь NIB:isopropanol позволяет чистить ПЦР-фрагменты добавляя менее одного объёма преципитационного буфера.

    • По пунктам

      п. 1.

    • AB. Крезоловый красный введён в AB как краситель, изменяющий цвет в зависимости от pH: жёлтый при pH<7.5 и красный при pH>7.5. Дело в том, что связывание ДНК с мембраной резко ухудшается при pH>7. Если цвет смеси (п.1) оказался оранжевым или фиолетовым, следует уменьшить pH добавив немного 3M ацетата натрия, pH 4. Крезоловый красный можно не добавлять, если протокол очистки уже оптимизирован для конкретного PCR буфера или этот краситель входит в состав PCR-смеси. MES - делает протокол более устойчивым. GuSCN и этанол обеспечивают адсорбцию ДНК на стекло и денатурацию белков.
    • п. 3.

    • PB4. Буфер состоит из GuSCN и EDTA. EDTA введён для отмывки от одноцепочечных нуклеиновых кислот (Beld M, Sol C, Goudsmit J, Boom R. Fractionation of nucleic acids into single-stranded and double-stranded forms. // Nucleic Acids Res. 1996 Jul 1;24(13):2618-9.). Именно EDTA обеспечивает отмывку от праймеров и одноцепочечных фрагментов DNA.
    • п. 9.

    • WB. Это - забуференный 80% этанол. Он используется для того, чтобы отмыть мембрану от хаотропных солей. Tris — необходимый компонент WB, так как чистый 80% этанол денатурирует двухцепочечную ДНК во время промывки.
    • п. 12.

    • EB. Низкосолевой буфер с pH в районе 7.0 - 8.5. В принципе, можно использовать просто воду, но нужно убедиться, что её pH находится в указанных пределах.


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


    Дополнения, комментарии, вопросы





       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler