Главная страница MolBiol.ru > Методы > Real-time PCR > Общий принцип Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

1. Общий принцип real-time PCR

a11

    Real-time PCR - это семейство методик количественного PCR со следующими чертами:

    1. Определение выхода продукта реакции после каждого цикла амплификации.
    2. Построение по этим данным кинетической кривой PCR.
    3. Определение относительной концентрации субстрата на основании анализа этой кривой.

    Для детекции PCR-продукта используются флуоресцентные красители, обеспечивающие флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству ПЦР-продукта - репортерную флуоресценцию. Механизмы генерации репортерной флуоресценции различаются в зависимости от типа real-time PCR.


    Кинетическая кривая PCR в координатах "Уровень репортерной флуоресценции — цикл амплификации" имеет сигмоидную форму (Рис. 1). В ней можно выделить три стадии:

    1. Стадию инициации (когда PCR-продукты еще не детектируется флуоресцентной меткой).
    2. Экспоненциальную стадию (в которой наблюдается экспоненциальная зависимость количества флуоресценции от цикла PCR).
    3. Плато (стадию насыщения).

    Рис. 1. Кинетические кривые real-time PCR

    Экспоненциальная стадия PCR описывается уравнением:


    Pn = P0 * E n     (1)

    где Pn - количество молекул продукта/репортерной флуоресценции к циклу n, P0 - исходное количество молекул, содержащих амплифицируемый фрагмент (template), E - эффективность амплификации. В идеальных условиях E = 2, т.е. на каждом цикле цепной реакции происходит удвоение количества продукта.


    Прологарифмируем обе части уравнения 1 и преобразуем его к виду:


    n = - (1/log E) * log P0 + log Pn/log E     (2)

    Назовем пороговым циклом (threshold cycle, C(T)) такой цикл n, на котором достигается некий заданный уровень репортерной флуоресценции - пороговая флуоресценция PC(T)=const. Для n=C(T) уравнение 2 принимает вид:


    C(T) = - (1/log E) * log P0 + log PC(T)/log E     (3)

    Т.е. значение С(T) прямо пропорционально логарифму количества субстрата. Таким образом, real-time PCR позволяет сравнивать количества субстрата при условии, что эффективность реакции и заданный уровень пороговой флуоресценции одинаковы для каждой из сравниваемых реакций.



      1. Общий принцип real-time PCR следующая часть




MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 47197

    Дополнения, комментарии, вопросы

    _KovalG_ /11.01.2006 23:39/
    Higuchi et Al. для подсчета концентрации использовали величину, при которой флюоресценция пробы начинала привышать фон, таким образом порог чувствительности оптической системы прибора становился стандартом для подсчета количества ДНК копий.
    Проблемы связанные с флуктуацией фонового уровня и различиями между образцами способствовали созданию нового метода. Данный метод основан на том, что исследователь ограничивает лог-фазу на кривой, которая и %



    Horse-radish /20.11.2015 13:19/
    Такая ситуация: воркфлоу RNA pur-n>RT>qPCR preparation, в формате одной комнаты. Понимаю что это не по феншую. Хорошо хоть циклер в другой комнате. Как половчее минимизировать кроссконтаминацию уф-боксами и ламинарами?



    blij /20.11.2015 18:06/
    (Horse-radish @ 20.11.2015 12:19)
    Ссылка на исходное сообщение  Такая ситуация: воркфлоу RNA pur-n>RT>qPCR preparation, в формате одной комнаты. Понимаю что это не по феншую. Хорошо хоть циклер в другой комнате. Как половчее минимизировать кроссконтаминацию уф-боксами и ламинарами?

    походите со свечкой, посмотрите в какую сторону возд. потоки в комнате двигаются smile.gif Обязательно используйте урацил гликозидазу, чтобы продуктами ПЦР контаминации не происходило. А вообще, лучше заранее смиритесь, что засёры в Вашей ситуации неизбежны и хотя бы расфасуйте запасные батчи всех реагентов в заведомо назагрязненной среде.








       


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/
_MPI-MP_ /11.01.2006 23:33/
Real time PCR на странице Microbiology and Immunology On-line University of South Carolina: http://pathmicro.med.sc.edu/pcr/realtime-home.htm ( http://pathmicro.med.sc.edu/pcr/realtime-home.htm )






Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler