Главная страница MolBiol.ru > Методы > Сиквенс > Ферментативная реакция Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Cиквенсовая реакция

 

    Для ssDNA

    Отжиг

  1. приготовить смесь:
  2. H2O до суммарного V => 5µl,
    5x буфер 1µl
    Primer 0.5µl (0.5pmol/µl)
    ss DNA ?[µg] => 0.16 x размер[kbp]
  3. 2' на температуре > 65oC, медленно остудить до <35oC (15-30'), сразу в лед;
  4. Реакция

  5. раскапать терминирующие смеси по 1.25µl, NT;
  6. приготовить разбавленный Lab. mix -> в лед;   


  7. Кол-во реакций 1 x 3.3 x 5.5 x 6.5 x 15.5
    DTT 0.5µl 1.7 2.8 3.25 7.75
    Lab.mix 0.2µl 0.7 1.1 1.3 3.1
    H2O 0.8µl 2.6 4.4 5.2 12.4
    a[33P]dATP 0.25µl 0.8 1.4 1.6 3.9
    Seq/Taq pol. 1µl 3.3 5.5 6.5 15.5
  8. к смеси отжига добавить разбавленный Lab. mix по 2.75µl;
  9. NT(~18oC), 2-5';
  10. во время мечения поставить пробирки с терминирующими смесями в ЦФ; за 30'' до конца мечения открыть крышки;
  11. по 1.8µl в терминирующие пробирки ;
  12. 37oC, 5';
  13. 70oC, 10';
  14. 0oС, ~2';
  15. + 2µl "Stop".
  16. 0oС;
  17. непосредственно перед нанесением на гель: 80oС, 2', затем сразу в лед ~ 2'.


  18. Для dsDNA

    На наш взгляд более удобен метод щелочной денатурации.

  19. приготовить смесь:
  20. pDNA 3.25µl => (0.5-1µg),
    Primer/NaOH => 0.75µl;

  21. 37oC 10';
  22. + 1µl нейтрализующего раствора;
  23. сравнить цвет с серией стандартов: нужно, чтобы pH был в районе 7.0-8.0, для коррекции добавлять по 0.1µl 0.1M NaOH (или HCl);
  24. 37oC 5';
  25. далее, начиная с п. 3 для ssDNA.


  26. Альтернативный метод – тепловая денатурация

    Сообщалось, что если проводить денатурацию в присутствии буфера, то получится высокий фон и шмер; если добавлять буфер после денатурации, то все нормально (на наш взгляд, очень странно):

  27. приготовить смесь:
  28. pDNA 3.5µl (0.5-1µg),
    Primer (0.5pmol/µl) 0.5µl;

  29. 97oC, 5';
  30. ЦФ, NT;
  31. + 1µl 5x Seq. Buf.;
  32. отжиг 15' 37oC;
  33. далее, начиная с п. 3 для ssDNA.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 14924

    Растворы

    Primer/NaOH

    6.6x (хранить при -20oС)

    Конц.Сток3µl50µl
    Primer1.33µM2pmol/µl2µl33.3µl
    NaOH0.33N1N1µl16.7µl

    Нейтрализующий раствор

    5x (хранить при -20oС)

    Конц.Сток4µl50µl
    Cresol Red (Na)0.25mM1mM1µl12.5µl
    NSA5x10x2µl25µl
    HCl0.25N1N1µl12.5µl

    NSA

    Non Salt Annealing buffer, 10x

    Конц.Сток1ml
    TrisCl (pH 7.5)0.4M1M400µl
    MgCl20.2M1M200µl
    H2O mQ400µl

    STOP

    Буфер для нанесения

    Конц.Сток1ml
    Формамид96%100%960µl
    EDTA20mM0.5M40µl
    Бромф. синий0.05%тв.0.5mg
    Ксилен-цианол0.05%тв.0.5mg


    Комментарии

    По пунктам

    п. 2.

  • Нормальный темп охлаждения - если используется 0.5L стакан со 100ml H2O.
  • п. 3.

  • Если матриц для сиквенса не слишком много (~10-15), удобно подписывать терминирующие пробирки во время отжига. Если их больше - лучше сделать это заранее.
  • Мы предпочитаем подписывать пробирки для отжига и терминирующие пробирки циклически, чередуя фломастеры 4х различных цветов (каждая матрица/ терминирующая пробирка имеет свой соответствующий цвет, чтобы не запутаться при манипуляциях).
  • п. 4.

  • a[33P]dATP - от 0.25µl до 0.5µl в зависимости от свежести метки.
  • Мы используем смесь Sequenase*:Tag pol.=20u:1u (*разведённая в глицерол-содержащем буфере). Tag pol. работает в п. 10; её функция – продолжить места неспецифической остановки Sequenase. Такая модификация протокола весьма проста, но даёт очень хорошие результаты – мы практически никогда не сталкиваемся со "strong stop’s".
  • п. 14.

  • Сообщалось, что добавление DMSO до 10% на этапах мечения и терминации или Formamide 10% на этапе отжига, способны существенно улучшить сиквенсовую картинку (Sequenase спокойно выдерживает присутствие 10% formamide).
  • Образцы c 35S и 33P могут храниться неделю при -20°C. Образцы с 32P должны быть разогнаны на форезе в тот же день.
  • п. 15.

  • Внимание! При приготовлении ds pDNA для сиквенса endA+ штаммы дают никованную DNA, которая приводит к появлению "фоновых полос" на сиквенсовом геле. Лучше использовать endA- штаммы типа DH5a, SURE, JM109, JM105.


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


    Дополнения, комментарии, вопросы





       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler