Главная страница MolBiol.ru > Методы > Геномная ДНК > Выделение из мух (c DEPC) Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Выделение DNA из мух c DEPC

Быстрый и удобный способ, DNA вполне годится для Southern анализа или PCR.
  1. 100-150 мух поместить в 1.7ml пробирку;
  2. добавить 500 µl "рабочего раствора", раздавить пестиком;
  3. 70oС, 30';
  4. добавить 116µl AcOK (5M);
  5. 0oС 30';
  6. ЦФ 0oС, 5';
  7. супер перенести в новую пробирку с 350µl изопропанола;
  8. NT, 5', осадить;
  9. промыть 70% EtOH;
  10. растворить в H2O (TE) из расчета 1µl на муху.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 9854

    Растворы

    Сток А

    (хранить при 4oС):

    Конц.Сток50ml100ml
    Tris Cl, pH 9.00.1M1M5.0ml10.0ml
    EDTA0.1M0.5M10.0ml20.0ml
    H2O mQ35.0ml70.0ml

    Рабочий раствор

    (свежеприготовленный):

    Конц.Сток2ml3ml10ml
    A0.9x1.0x1.8ml2.7ml9.0ml
    SDS1%10%0.2ml0.3ml1.0ml
    DEPC1%100%20µl30µl0.1ml


    Комментарии

    Общие

  • Содержание DNA в мухах: самец ~ 0.75µg, самка ~ 1µg.


  • По пунктам

    п. 2.

  • Лучше делать это в охлажденной до 0oС пробирке. При этом SDS выпадает в осадок и его кристаллы помогают как следует растереть мух.
  • п. 3.

  • Лизис, модификация белков DEPC.
  • п.5.

  • Ионы К+ с SDS осаждают белки.

    Дополнения, комментарии, вопросы

    мух /02.06.2005 13:28/
    очень хочется чтобы протокол был более полным



    мух /02.06.2005 13:28/
    очень хочется чтобы протокол был более полным



    Гость /14.07.2008 09:45/
    Протокол, который я использую при сходном составе буферов.
    1. Поместить одну-несколько мух (можно - любые другие организмы, которые можно легко растереть пестиком в пробирке; спиртованный материал - предварительно подсушить) и залить 200 мкл "рабочего раствора".
    2. Гомогенизировать содержимое пробирки.
    3. Инкубировать при 65 град. 30 мин.
    4. Добавить 300 мкл 5М/3М Ацетата калия (3М ацетата калия + 2М - уксусной кислоты). Перемешать.
    5. Инкубировавть на льду 30 мин.
    6. Перемешать; центрифугировать 10 мин при 13 тыс об/мин.
    7. Перенести супернетант в новую пробирку.
    8. Добавить равный объём 96% этанола (500 мкл).
    9. Перемешать. Оставить на столе на 5-10 мин.
    10. Центрифугировать 10 мин 13 тыс об/мин.
    11. Удалить супернатант. Добавить 96% этанол (400 мкл).
    12. Перемешать, так, чтобы осадок не при этом не оказался прилипшим к части пробирки не смачиваемой спиртом. Оставить на столе на 3-5 мин
    13. Центрифугировать 3-5 мин при 13 тыс об/мин.
    14. Тщательно отобрать спирт.
    15. Подсушить осадок в пробирках, оставив их открытыми в микротермостате при 37 град не менее 20 мин.
    16. Растворить в 50 мкл воды.

    При таком выделении ДНК может существенно (для ПЦР) деградировать при хранении более 6 мес при 4 град.








       


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler