Главная страница MolBiol.ru > Методы > Геномная ДНК > Выделение ДНК из растений Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Выделение геномной ДНК из растений

Георгиева София,
Институт Молекулярной Биологии
  1. ткань растереть в ступке с жидким азотом до светло-зелёной (а не темно-зелёной) пудры;
  2. подготовить прогретую до 65оС пробирку с 2x CTAB (из расчёта 25ml 2x CTAB на 2 - 5g ткани);
  3. перенести пудру шпателем в пробирку, очень хорошо и быстро перемешать;
  4. инкубировать при 65оС минимум 20' (лучше 1h, но можно и больше: 2 - 3h);
  5. охладить до NT, добавить равный объём Хлороформа:Изоамилового спирта (Ch:I=24:1), перемешивать ~20' NT;
  6. ЦФ 5krpm NT, 10';
  7. снять водную фазу, добавить к ней 0.2V 5xCTAB;
  8. перемешать, инкубировать при 65оС 10';
  9. добавить равный объём Ch:I, перемешивать ~10' NT;
  10. ЦФ 5krpm NT, 10';
  11. если раствор мутный или большая интерфаза - повторить экстракцию Ch:I (пункты 9 и 10);
  12. добавить равный объём буфера для преципитации (можно и 2 - 3 объёма), перемешать и оставить на 1h (или на ночь) при NT;
  13. ЦФ 5 - 8 krpm NT, 20' (если ДНК не выпадает, добавить больше буфера для преципитации, оставить на комнатной температуре на 1h, отцентрифугировать);
  14. растворить осадок в 1 - 2 ml HS-TE (иногда необходим нагрев до 65оС);
  15. добавить 2V EtOH (абс.), 1 - 2h при -20оС или 30' при -70оС;
  16. ЦФ 8 krpm 4оС, 10';
  17. к осадку добавить 200µl дистиллированной H2O и 100µl 7.5M NH4Ac (pH 7.5) 20', 0оС;
  18. ЦФ 13 krpm 4оС, 10';
  19. добавить к супернатанту 2V EtOH (абс.) 20' при -70оС;
  20. ЦФ 13 krpm 4оС, 10';
  21. сполоснуть 80% EtOH;
  22. растворить в TE или H2O;
  23. хранить при -20оС.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 27650

    Растворы

    2xCTAB буфер

    (хранить при NT):

    Конц.Сток100ml500ml
    CTAB2%(w/v)тв.2.0g10.0g
    NaCl1.4M58.44g/M8.18g40.9g
    Tris Cl, pH 8.00.1M1M10ml50ml
    EDTA20mM0.5M4ml20ml
    H2O mQ   
    CTAB = Cetyltrimethylammoniumbromid
    CTAB растворяется плохо (я нагревала для растворения в микроволновой печке), поэтому лучше приготовить раствор заранее).

    5xCTAB буфер

    (хранить при NT):

    Конц.Сток50ml100ml
    CTAB5%(w/v)тв.2.5g5.0g
    EDTA350mM0.5M35ml70ml
    H2O mQ   

    Буфер для преципитации

    (хранить при NT):

    Конц.Сток100ml500ml
    CTAB1%(w/v)тв.1.0g5.0g
    Tris Cl, pH 8.050mM1M5ml25ml
    EDTA10mM0.5M2ml10ml
    H2O mQ   

    HS-TE буфер

    (хранить при NT):

    Конц.Сток100ml500ml
    NaCl1M58.44g/M5.84g29.22g
    Tris Cl, pH 8.010mM1M1.0ml5.0ml
    EDTA1mM0.5M0.2ml1.0ml
    H2O mQ   
    CTAB = Cetyltrimethylammoniumbromid


    Комментарии

    Общие

  • Источник: S. O. Rogers & A. J. Bendich Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues. Plant Molecular Biology. 5; 69-76, 1985 (с модификациями).
  • Листья можно хранить при -70оС.
  • Выход: в зависимости от типа ткани: 0.3 - 200ng DNA на 1mg ткани. В наших руках из листьев арабидопсиса получалось 80ng/mg. Наибольший выход из эмбрионов и листьев, наименьший - из органов хранения крахмала.
  • Получается ДНК размером 40 - 70kbp. Годится для рестрикции и PCR.
  • Принцип работы CTAB описан в протоколе "Другие методы осаждения ДНК(РНК) - PEG, Zn, CTAB".
  • Автор методики не является специалистом по работе с растениями, но работала с этой методикой и она понравилась. Поэтому, если у кого-то есть комментарии или какие-то другие способы, было бы приятно о них узнать.


  • По пунктам

    п. 1 - 3.

  • Видимо, если количество ткани небольшое, удобнее добавлять буфер непосредственно в ступку и растирать и его тоже. Для совсем маленьких образцов используется пестик для микроцентрифужных пробирок (в этом случае имеет смысл добавлять ~20µg tRNA как носитель).
  • п. 7.

  • Экстракция хлороформом может уменьшить объём водной фазы. В таких случаях требуется добавить 1хCTAB буфер до исходного объёма.


  • Дополнение о подготовке растений.

    Ким Елена (kimuch_xx1@mail.ru), магистрантка каф. Цитологии и гистологии СПбГУ, БИН РАН - лаб. Биосистематики и цитологии.

    Если нет жидкого азота, то ткань можно высушить в термостате на +37oC (пока она не станет хрупкой), затем перетереть в тонкий порошок в обычной лабораторной ступке диаметром до 10cm с минимальным количеством оксида алюминия (минимальное количество - так чтобы не прилипало к пестику и дну ступки). Для выделения брать около 0.5ml (в 1.5ml пробирке Эппендорф). Если не вся ткань перетерта, хранить её можно при комнатной температуре в новом полиэтиленовом пакетике с пластиковой застежкой.

    Этот метод я применяла для широкого спектра растительных объектов в пределах Лилейных, Амариллисовых, Аспарагусовых и пр. В основном использовалась ткань листьев. Выделенная ДНК использовалась для блот/дот-гибридизации, ПЦР.



Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


    Дополнения, комментарии, вопросы

    error /13.07.2005 17:56/
    Можно выделять аналогичным способом ДНК из совсем небольших количеств материала - 20-150 мг. Измельчение производится прямо в эппендорфе спец. пестиком или заплавленным типом на 1000 мкл. Метод работал с лиственничной хвоей - в сухом виде, свежей и замороженной, а также с проростками лиственницы, кукурузы, пшеницы и пр. Единственное - тонкостенные пробирки при экстракции хлороформом разрывало в центрифуге, так что следует подбирать качественные эппендорфы - Treff, Axygen и т.п.



    Гость /14.07.2005 14:18/
    Метод хороший и мы использовали его много раз .Но бывает примесь РНК.



    Fox /16.07.2005 20:07/
    Метод хороший и если качество устраивает можно значительно сокращать время и количество шагов.
    Отлично работает на моллюсках (есть и коммерческий кит) и головастиках с добавлением ProK на стадии перевара. Из свежего материала всегда получается много РНК.



    Saveta /10.10.2005 11:29/
    Метод хороший. Пошел и на грибах. Работали на микрокол-вах.
    Пришлось (по материальным причинам) исключить пункт 17 и использовать чистый Хлороформ (насыщенный водой) вместо смеси. А когда пришлось работать без азота, растирала свежий мицелий с буфером - и несмотря на все это - получалось норамально.



    Cerevisia /12.10.2005 14:09/
    После инкубации на 65 (30 мин) добавляю равный обьем фенол:хлороформ (1:1), мешать, центрифугировать, снять верхнюю фазу. Добавить равный обьем хлороформа, мешать, центрифугировать, снять верхнюю фазу. Осаждать 0.75 обьемом изопропилового спирта - 10 мин при комнатной температуре. Осадить, осадок промыть этанолом 70%. ДНК годится для ПЦР.
    При желании можно почистить РНКазой и повторить фенольно-хлороформную очистку.



    Гость /06.02.2007 18:58/
    У меня токой вопрос. После осаждения ДНК с изопропанолом и центрифугирования, я осадок (ДНК) оставил на ночь в CH3COONa+спирт 76%. Потом отцентрифугировали и добавили воды, но ДНК не растворился. Добавили понемногу больше воды, но полюбому не получилось. Какова может быть причина? (метод Murrey-Thompson)



    ада /29.06.2007 03:23/
    привет а у меня вопрос подскажите пожалуйста где искать выделение днк из фитофторы ну очень нужно



    Grumeza Radu /04.07.2007 11:17/
    (Гость @ 06.02.2007 16:58)
    Ссылка на исходное сообщение  У меня токой вопрос. После осаждения ДНК с изопропанолом и центрифугирования, я осадок (ДНК) оставил на ночь в CH3COONa+спирт 76%. Потом отцентрифугировали и добавили воды, но ДНК не растворился. Добавили понемногу больше воды, но полюбому не получилось. Какова может быть причина? (метод Murrey-Thompson)

    У вас там Polysaccharides завелись (или другие примеси), днка дуба, розы итгд имеют ету неприятную особенность. Растворяется водой (Ph8) 1-3 hours at 65-75 degrees celsius



    Гость /06.02.2008 13:39/
    Как очистить ДНК,выделенную из проростков пшеницы, с низким показателем чистоты - 1,1405?



    Гость /30.08.2008 14:19/
    Скажите а сколько можно хранить растворы с ЦТАБ???



    Cerevisia /02.09.2008 12:09/
    (Гость @ 30.08.2008 11:19)
    Ссылка на исходное сообщение  Скажите а сколько можно хранить растворы с ЦТАБ???


    смотря как хранить и для чего. Для пцр<1000 нк храню в холодильнике при +4 до двух месяцев. Для длинных пцр замораживаю и храню на - 20 до полугода.



    Гость /07.10.2008 06:19/
    Большое спасибо!!!



    Guest /07.10.2008 13:00/
    http://www.mrcgene.com/dnazoldirect.htm ( http://www.mrcgene.com/dnazoldirect.htm )



    Aschenputtel /01.03.2009 00:39/
    Этот метод пригоден не для всех видов растений. Из растнений, которые содержат большое количество полифенольных соединений (или еще какой-то дряни) этим методом выделять невозможно, точнее, выделенная этим методом ДНк требует дополнительной очистки



    guest: Николай /12.03.2009 21:18/
    Есть мнение, что в ткани растений подготовленной для выделения ДНК высушиванием, начинают работать ДНК-аза и другие активности. Значит будут потери и искажения результатов. Что ученый народ скажет о таком методе?



    mlog /12.03.2009 21:24/
    (guest: Николай @ 12.03.2009 21:18)
    Ссылка на исходное сообщение  Есть мнение, что в ткани растений подготовленной для выделения ДНК высушиванием, начинают работать ДНК-аза и другие активности. Значит будут потери и искажения результатов. Что ученый народ скажет о таком методе?

    Не замечала никаких отрицательных эффектов, если быстро высушить. Иногда даже специально высушиваю - не люблю из свежего материала ДНК выделять.



    Ъ /13.03.2009 10:16/
    (mlog @ 12.03.2009 20:24)
    Ссылка на исходное сообщение  Не замечала никаких отрицательных эффектов, если быстро высушить. Иногда даже специально высушиваю - не люблю из свежего материала ДНК выделять.

    Специально сушите материал? А выделяете ДНК каким методом из "гербария"? confused.gif



    mlog /13.03.2009 16:42/
    (Ъ @ 13.03.2009 09:16)
    Ссылка на исходное сообщение  Специально сушите материал? А выделяете ДНК каким методом из  "гербария"? confused.gif

    Как-нибудь вот так: http://molbiol.ru/forums/index.php?showtopic=141403 ( http://molbiol.ru/forums/index.php?showtopic=141403 )
    или киагеновским/любым аналогичным китом. Именно что из гербария - я же ботаник по образованию, это у меня ещё с курсовой привычка smile.gif



    Ъ /13.03.2009 17:42/
    (mlog @ 13.03.2009 15:42)
    Ссылка на исходное сообщение  Как-нибудь вот так: http://molbiol.ru/forums/index.php?showtopic=141403 ( http://molbiol.ru/forums/index.php?showtopic=141403 )
    или киагеновским/любым аналогичным китом. Именно что из гербария - я же ботаник по образованию, это у меня ещё с курсовой привычка smile.gif

    Эта методика не для ленивых - вот что я вам скажу. smile.gif Попробуйте плавно перейти вот на эту методику, которую наша девушка там, в Канаде, опубликовала:
    http://www.springerlink.com/content/a46t76...00/fulltext.pdf ( http://www.springerlink.com/content/a46t76546r128400/fulltext.pdf )



    mlog /13.03.2009 18:33/
    (Ъ @ 13.03.2009 17:42)
    Ссылка на исходное сообщение  Эта методика не для ленивых - вот что я вам скажу. smile.gif  Попробуйте плавно перейти вот на эту методику, которую наша девушка там, в Канаде, опубликовала:
    http://www.springerlink.com/content/a46t76...00/fulltext.pdf ( http://www.springerlink.com/content/a46t76546r128400/fulltext.pdf )

    Ой, а не пришлете мне статью? А то тут нет доступа frown.gif
    (fagopyrum -at- list.ru)
    А один из авторов, Hebert - это баркодер, что ли?



    Ъ /13.03.2009 18:39/
    (mlog @ 13.03.2009 17:33)
    Ссылка на исходное сообщение  Ой, а не пришлете мне статью? А то тут нет доступа frown.gif
    (fagopyrum -at- list.ru)
    А один из авторов, Hebert - это баркодер, что ли?

    Кто такой Hebert, спросите у Наташи.
    Мария, Вам придется мыло выставлять для фултекста.



    mlog /13.03.2009 18:49/
    Так я же написала - fagopyrum@list.ru
    просто @ на -at- заменила, как это обычно делают.



    Ъ /13.03.2009 18:51/
    (mlog @ 13.03.2009 17:33)
    Ссылка на исходное сообщение  Ой, а не пришлете мне статью? А то тут нет доступа frown.gif
    (fagopyrum -at- list.ru)
    А один из авторов, Hebert - это баркодер, что ли?

    Отправил.



    guest: Ник /01.12.2014 02:36/
    Из живых веток получится?








       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler