Главная страница MolBiol.ru > Методы > Геномная ДНК > С использованикм мочевины Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Выделение геномной DNA (с мочевиной)

  1. тщательно гомогенизировать образец в 100µl HB в эппендорфе с помощью "пестика";
  2. довести объем HB до 300µl;
  3. экстракция фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (ФХИ)= 25:24:1 (перемешивать осторожно);
  4. ЦФ на максимальной скорости 5';
  5. ре-экстрагировать интерфазу 100µl HB;
  6. повторить пункт 4;
  7. объединить старую и новую верхние фазы и экстрагировать ФХИ ещё 2-3 раза;
  8. экстракция хлороформом;
  9. преципитация 2.5V EtOH, перемешать аккуратно, ЦФ на максимальной скорости 10-15';
  10. высушить под вакуумом;
  11. растворить в 500µl ТЕ;
  12. добавить 1/10 объема NaAc pH 5.2, добавить 2.5V EtOH;
  13. ЦФ на максимальной скорости 10-15';
  14. промыть 70% EtOH, высушить вакуумом, растворить в воде или в 10mM Tris-HCl, pH 8.5.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 13586

    Растворы

    HB (Homogenization Buffer)

    (хранить при NT):

    Конц.Сток100ml500ml
    SDS2%(w/v)10%20ml100ml
    EDTA10mM0.5M2ml10ml
    NaCl0.35M5.0M7.0ml35.0ml
    Tris Cl, pH 8.00.1M1M10ml50ml
    Urea7M60.06g/M42.04g210.21g
    H2O mQ29.1ml145.6ml


    Комментарии

    Общие

  • Holmes-Bonner genomic DNA preparation.
  • Недостатки: этот метод дает немного меньшие количества DNA, чем с Proteinase К. DNA, возможно, немного грязнее - не проверял, не знаю.
  • Достоинства: дешево; быстро - 1-1.5 часа. Я эту DNA использовал для мечения и гибридизации на микроматрицах, получилось очень хорошо.
  • Можно использовать и в максипреп-варианте: приблизительно 5-10ml на 1g ткани (речь идёт о печени кролика). /дополнение от mesentsev/
  • Позволяет выделять также и RNA (само собой, надо обработать все, чтобы было RNase free и, естественно, не добавлять RNase :) ). Причем в хороших количествах и состоянии.


  • По пунктам

    п. 1.

  • Чем лучше гомогенизируете, тем больше DNA :). Так как HB содержит SDS — в лед его ставить не надо.
  • п. 7.

  • На этой стадии можно добавить RNase (100µg/ml) и инкубировать 15-30', 37oC. После этого - ещё раз ФХИ и дальше по списку.
  • п. 12.

  • Здесь можно прерваться: поставить пробирки на -20C, если нужно.
  • п. 14.

  • Если нет вакуумной центрифуги, можно промыть 96% EtOH, удалить весь спирт и высушить на воздухе.

    Дополнения, комментарии, вопросы





       


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler