Главная страница MolBiol.ru > Методы > Геномная ДНК > Выделение ДНК из растений Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Очистка геномной ДНК из растений на силика-колонке

 
  1. в пробирку добавить:
       ~50µl B1-буфера,
       ~20mg стеклянной крошки,
       ~50÷100mg (влажной массы) листьев,
       ~2µl Antifoam A
  2. растереть пестиком до исчезновения комков;
  3. добавить 4µl RNaseA (100mg/ml), смешать на вортексе;
  4. 10' при 65oC, несколько раз перемешать;
  5. добавить 400µl смеси хлороформ:изоамиловый спирт (24:1), смешать;
  6. добавить 130µl B2, вортексировать;
  7. инкубировать 5' при 0oC (ледяная баня);
  8. ЦФ 5' NT;
  9. аккуратно снять супер (для Арабидопсиса получается ~500µl) и, если проскочили мелкие крошки, повторить ЦФ 5' NT;
  10. добавить к супернатанту 1.5V B3/Ethanol (1:2), смешать;
  11. в несколько нанесений по 600µl нагрузить GF/F колонку (ЦФ NT, 30'');
  12. 2x промыть колонку 650µl WB (ЦФ NT, 30'');
  13. просушить колонку 2' центрифугированием, поместить в чистую 1.5ml пробирку;
  14. нанести на колонку 10µl EB, инкубировать ~5' при 65oC;
  15. элюировать ДНК ЦФ 2' NT;
  16. хранить при -20оС.

    1. Растворы

      B1 Buffer

      (хранить при NT):

      Конц.Сток10.0ml50.0ml
      MES pH5.350mM1M0.5ml2.5ml
      EDTA10mM0.5M0.2ml1.0ml
      NaCl100mM5M0.2ml1.0ml
      SDS1%10%1.0ml5.0ml
      H2O mQ8.1ml40.5ml
      B2 Buffer: CH3COOK, pH 5.5, 3M
      см. здесь

      B3 Buffer

      (хранить при NT):

      Конц.Сток10.0ml50.0ml
      GuanidineCl8M95.53g/M7.64g38.2g
      MES pH5.550mM1M0.5ml2.5ml
      H2O mQ3.71ml18.55ml

      WB (washing buffer)

      (хранить при NT):

      Конц.Сток10.0ml50.0ml
      Этанол70%100%7.0ml35.0ml
      TrisCl, pH7.510mM1M0.1ml0.5ml
      KCl100mM2M0.5ml2.5ml
      H2O mQ2.4ml12.0ml

      EB (elution buffer)

      (хранить при 4oС):

      Конц.Сток10.0ml50.0ml
      TrisCl, pH8.510mM1M0.1ml0.5ml
      H2O mQ9.9ml49.5ml


      Комментарии

      Общие

    • Средний выход ~3µg на 100mg листьев (тот же результат получается на ките от Qiagen).
    • Так как ДНК не слишком много, то используются пробирки с одним silica-фильтриком диаметром 6mm. Емкость такой колонки должна быть ~ 6µg ДНК на колонку. Изготовление спин-колонки описано в протоколе Очистка pDNA на silica spin колонках.


    • По пунктам

      п. 1.

    • Стеклянная крошка используется как наждак для растирания ткани.
    • Antifoam A: #10794 Fluka
    • В принципе, метод отлично работает и без Antifoam A (только пены побольше), даже наоборот, без Antifoam A меньше зеленого пигмента попадает на следующий шаг — с виду раствор чище.
    • п. 1-2.

    • В этих пунктах важно хорошенько растереть растительную ткань. Можно действовать, как описано здесь, а можно использовать какие-то другие способы гомогенизации (с помощью стальных шариков или др.).
    • п. 2.

    • Либо использовать фабричный пластиковый пестик, либо сделать пестик самому из легкоплавкого пластика (мы пробовали из одноразовых шпателей для растирания бактерий): пластик разогревается до размягчения и с силой вдавливается в пробирку.
    • п. 3.

    • В принципе, RNaseA не слишком охотно работает в SDS-содержащем буфере. Но здесь её добавляется так много, что она вполне справляется (заранее добавлять не надо!).
    • п. 5.

    • Можно обойтись и без хлороформа, но с ним супер существенно чище и не требуется проводить дополнительное ЦФ в п.9.
    • п. 11.

    • Наверное, можно грузить под вакуумом, но мы не пробовали.
    • п. 12.

    • WB может быть без одновалентной соли или содержать NaCl или KCl — результаты одинаковые.
    • п. 15.

    • При элюции в 10, 20, 40, 80µl сходит одинаковое количество ДНК (вполне возможно, что можно использовать менее 10µl).




Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


    Дополнения, комментарии, вопросы






       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler