Главная страница MolBiol.ru > Методы > RNA > Выделение RNA из тканей Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Выделение RNA из тканей мыши

 
  1. ткань залить жидким азотом в керамической ступке, растереть в порошок;
  2. долить жидкий азот, добавить GTB (объём - смотри таблицу);
  3. залить жидким азотом, растереть в порошок;
  4. перенести лизат в пробирку, расплавить;
  5. добавить 1/10V AcONa, pH5.0 (3M);
  6. смешать (и заодно раздробить DNA) несколько (3-4) раз пропустив лизат через ~19G иглу;
  7. добавить 1V водонасыщенного фенола, смешать;
  8. NT, ~5';
  9. добавить 1/5V Х:I, интенсивно смешать/вортекс (3-4');
  10. ЦФ~1krpm, NT, 5-10';
  11. ЦФ>4krpm, NT, 10';
  12. перенести водную фазу в пробирку с 1V водонасыщенного фенола, смешать
  13. повторить пп.7,8;
  14. ЦФ>4krpm, NT, 10';
  15. экстрагировать хлороформом;
  16. добавить 1V изопропанола, смешать;
  17. -20oС, 1h-ON;
  18. ЦФ>4krpm, 4oС, 10-20';
  19. сполоснуть 75% EtOH;
  20. растворить в H2O(RNase free), хранить при -70oС.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 13400

    Растворы

    GTB

    guanidine thiocyanate buffer (хранить в 50ml аликвотах при -20oС).

    Конц.Сток30ml50ml200ml
    Guanidine thiocyanate4M118.16g/M14.18g23.63g94.5g
    Na citrate, pH 7.025mM1M0.75ml1.25ml5.0ml
    N-Lauroylsarcosine Na0.5%10%1.5ml2.5ml10ml
    b-MeEtOH*0.1M14.4M208µl347µl1.38ml
    H2O mQ16.7ml27.8ml111.2ml

    p=1.111
    *добавлять непосредственно перед использованием.

    Na citrate

    Na3C6H5O7x2H2O (хранить при 4oС):

    Конц.Сток50ml
    Na3C6H5O7x2H2O1M294.1g/M14.705g
    H2O mQ43.8ml

    p=1.17

    Приготовление RNA из органов мыши

    Орган. вес total RNA
    на 1mg
    ткани
    Volume
    GTB**
    на 1g
    из 1 мыши кол-во
    мышей на
    2.5mg RNA
    (mg)(µg)(ml)(mg)

    Liv

    печень

    1900112020.91

    Spl

    селезенка (м.б. 6µg/mg)

    1805500.93

    Kid

    2 почки

    4503201.352

    Ht

    сердце

    1801200.1814

    Lg

    лёгкие

    2001.9200.387

    Ton

    язык

    1201200.1221

    Pg

    2 prepuital glands

    652.7200.175515

    Mus

    мышцы (м.б. 1.3µg/mg)

    10000.8150.84

    Ts

    2 тестикулы

    2501.3250.3258

    Sv

    2 seminal vesicules

    1201.5200.1814

    Mg

    молочные железы

      ?  

    Ov

    2 яичника

    352.220?  

    Ut

    матка

    1403.720?  

    St

    желудок

    3001.8200.545

    Co

    кишка толстая

    5303.7201.9612

    In

    кишка тонкая

    13004.2205.461

    Ln

    лимфатические узлы L1-L5

    1203.450 to 700.4087

    Ty

    тимус (молодые)

    1002.150 to 700.2112

    Hg

    2 harderian glands

    203.230?0.06440

    Sg

    2 слюнные железы*

    1506.6300.993

    B-O

    2 обонятельные доли (мозг)*

    301.3300.03965

    B-e

    2 больших полушария (мозг)*

    2301.3300.2999

    B-l

    2 cerebellum*

    601.3300.07833

    B-M

    medulla*

    1501.3300.19513

    Ad

    надпочечники

    350.930  
    мышь30g 

    * для мозга, жировой ткани и слюнных желёз лучше проводить экстракцию с повышенным содержанием хлороформа (либо провести ЦФ ткани в GTB ещё до экстракции фенолом). Все эти меры нужны для того, чтобы избавиться от большей части жира (липидов), которые мешают экстракции.
         Возможно, что для мозга выход RNA занижен - должно быть ~2 µg/mg.
    ** Указанные значения - минимальные. Следует иметь в виду, что уменьшение объёма буфера приводит к весьма заметному снижению выхода RNA. Например, при экстракции RNA из 1g печени в 50ml GTB можно рассчитывать на ~10mg total RNA, а при экстракции в 5ml на ~3.5mg.
    Непроверенная информация Содержание totalRNA:

    кровь => 1-5 µg/ml,
    ооцит: => 0.35ng,
    32-клеточная стадия => 1.47ng,
    10 дневный эмбрион => 650 µg,
    соединительная ткань, хвосты, уши и т.п. => ~0.5 µg на 1mg ткани.



    Комментарии

    По пунктам

    п. 2.

  • Приготовление мелкодисперсной суспензии ткань + GTB. При оттаивании гуанидин тиоционат быстро проникает внутрь клеток и инактивирует RNase’s.
  • Порошок легко разлетается. Выливайте жидкий азот в ступку аккуратно (из небольшого пластикового стаканчика).
  • Обязательно работайте под хорошей тягой, иначе растертая в пыль мышка очень быстро сделает вас аллергиком.
  • п.4.

  • Можно при повышенной (до 50oС) температуре.
  • п. 5.

  • Закисление буфера. Лишь при низком рН экстракция фенолом уводит DNA из водной фазы. Мы не знаем, почему AcNa не включён в буфер GTB, и когда готовим буфер GTB непосредственно перед использованием, мы добавляем туда AcNa сразу.
  • п. 6.

  • Экстракция вязкого раствора чревата проблемами, связанными с тем, что DNA захватывает с собой RNA в органическую фазу. При пропускании раствора через иглу шприца размер молекул DNA уменьшается до ~50 kbp. На RNA эта процедура не влияет, так как её размер практически всегда <20kb.
  • п. 7 и 12.

  • Нам кажется, что эффективность описываемого метода связана с тем, что при экстракции фенолом получается однофазный раствор. Разделение фаз происходит лишь при добавлении хлороформа.
  • п. 10-11.

  • Центрифугирование проводится в два этапа, т.к. нам не нравится, когда грубые остатки тканей (шерсть, связки и т.п.) слишком энергично оседают на дно пробирки.
  • п. 17.

  • Лучше ON.
  • п. 20.

  • Мы предпочитаем пользоваться не H2ODEPC, а свежей mQ.
  • Хранение RNA: мы обычно храним RNA в H2OmQ, по видимому, грамотнее было бы использовать что-то типа 0.1хTE.
  • Непроверенная информация Ещё один способ - растворять RNA в формамиде (растворимость >4mg/ml). Преимущества формамида:
    1. в нём не работает RNase (нет деградации за 30' при NT в 50 µg/ml RNaseA);
    2. можно наносить на форез больший объём образца;
    3. RNA можно хранить и при -20oС.


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


    Дополнения, комментарии, вопросы

    Гость /14.08.2006 12:41/
    RNA лучше хранить в осадке под 70-96' спиртом (лучше 70') при минус 20'. Проверка RNA 5 летней давности на форезе показала ее хорошую сохранность и высокое качество.



    Aleksandar /15.04.2008 12:51/
    Pozdrav iz Srbije
    Zdravstvuj iz Srebiji
    Sory, I can't write you Russian from this computer.
    I need some help...
    If you have something about uncoding RNA, please send me e-mail on aderess enzo1320@yahoo.com
    hvala
    spasibo
    thank you



    Cinderella /15.07.2008 08:32/
    если приготовленный AcONa вовсе не pH5.0 а pH 8,7 , то чем его доводить до нужной рН, имеет ли значение для дальнейшего выделения РНК доведение рН раствора: ТХУ или НСl.



    Griva /17.07.2008 01:42/
    ТХУ странный выбор. я бы довел обычной уксусной кислотой (буфер ведь ацетатный). ну или в крайнем случае солянкой HCl. ну а вообще лучше из сухого приготовить заново с правильным рН- доводить уксусной кислотой.








       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler