Главная страница MolBiol.ru > Методы > RNA > Очистка polyA+ RNA Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Очистка polyA+RNA (на колонке)

По нашему опыту основным преимуществом хроматографической очистки перед седиментационными методами является больший выход высокомолекулярной mRNA (особенно опасен в этом отношении метод, связанный с гибридизацией mRNA c Bio(dT)12-20 с последующей адсорбцией на стрептавидин-парамагнитные частицы - в наших руках он давал приличный выход лишь до ~3kb).

    Приготовление колонки

  1. суспензировать соответствующее количество oligo (dT) cellulose в стерильной H2O (1g -> 2.5-3.5ml);
  2. декантировать по крайней мере дважды
  3. (например, для 0.1g oligo(dT) cellulose => ресуспензировать в ~12ml H2O в 15ml ЦФ-пробирке, дать осесть под действием силы тяжести ~10', снять надосадочную жидкость, повторить);

  4. заполнить колонку:
  5. * вылить суспензию в колонку в 1xCLB (в нём пузырьки воздуха легче проходят сквозь штифт);
    * дать стечь так чтобы ~1/2 колонки осталась заполненной;

  6. ввести верхний штифт (либо перевернутым желтым типом, либо обрезанной 1ml пипеткой);
  7. сполоснуть ~3Vcolumn 0.1М NaOH;
  8. промывать 1xCLB до тех пор, пока pH элюата не будет в районе 8.0 (~5Vcolumn).


  9. Хроматография

  10. растворить RNA в стерильной H2O;
  11. 65-70oC, 5';
  12. быстро охладить в водяной бане до NT (но не ниже!!! );
  13. добавить равный объём 2ХCLB;
  14. нанести на колонку;
  15. сполоснуть 5-10Vcolumn 1xCLB, (не обязательно => спектрофотометрически проконтролировать, что RNA смыта);
  16. прогреть колонку 70oС, 5';
  17. элюировать poly(A)+RNA ~2Vcolumn EB, 70oC (собирать фракции по 1/5-1/4Vcolumn);
  18. проанализировать А260, объединить фракции, содержащие mRNA.
  19. (обычно не нужно) после одного раунда очистки количество poly(A)+RNA~50%, вторая очистка способна довести чистоту до ~90%.

  20. переуравновесить колонку 1xCLB (щелочью не споласкивать);
  21. нагреть элюат до 65-70oC, 5';
  22. быстро охладить до NT, довести концентрацию NaCl до 0.5М (+1/10V 5M NaCl) и провести вторую хроматографию.


  23. Осаждение

  24. добавить
  25. 1/10V AcONa, 3M pH 5.2,
    2.5V EtOH 96%;

  26. -20oC, 1h-(лучше ON);
  27. ЦФ (лучше высокоскоростное), 4oС, 15-20';
  28. сполоснуть осадок 70% EtOH;
  29. растворить в H2O (получается 90-110% от количества, определенного спектрофотометрически после элюции).
  30. Регенерация колонки.

  31. сполоснуть колонку ~5Vcolumn0.1М NaOH;
  32. промыть:
    1. используется немедленно: промывать 1xCLB до тех пор, пока pH элюата не будет в районе 8.0 (5-10Vcolumn),
    2. использовать не сразу: уравновесить 0.5М NaCl хранить при +4oC;
    3. долговременное хранение: сполоснуть 50% EtOH, сушить под вакуумом, хранить при -20oC.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 9503

    Растворы

    CLB

    2х (хранить при 4oС):

    1х2хСток50ml100ml300ml
    Tris Cl, pH7.620mM40mM1.0M2.0ml4.0ml12.0ml
    NaCl0.5M1.0M5.0M10.0ml20.0ml60.0ml
    EDTA, pH8.01mM2mM0.5M0.2ml0.4ml1.2ml
    SDS0.1%0.2%10%1.0ml2.0ml6.0ml
    H2O  mQ36.8ml73.6ml220.8ml

    EB

    (хранить при 4oС):

    Конц.Сток10ml50ml150ml200ml
    Tris Cl, pH7.610mM1.0M0.1ml0.5ml1.5ml2.0ml
    EDTA, pH8.01mM0.5M20µl100µl300µl400µl
    SDS0.05%10%50µl250µl750µl1.0ml
    H2O mQ9.83ml49.15ml147.45ml196.6ml


    Комментарии

    Общие

  • Принцип хроматографии: oligo(dT), ковалентно связанная с целлюлозой, образует ds-гибриды с polyA-хвостами mRNA при концентрации соли 0.5М. Эти гибриды дестабилизируются при прогреве в низкосолевом буфере.
  • После одного раунда хроматографии получается ~1-4% (в зависимости от источника) от исходного количества RNA, после второго раунда (~30-60% от первого) => 0.3-2.5% от исходного количества RNA.
  • С 0.1g колонки можно получить ~100µg poly(A)+RNA.
  • Одну колонку можно использовать более 10 раз.


  • По пунктам

    п.1-6.

  • oligo(dT) целлюлоза берётся из расчета: 1ml колонка на 10mg totalRNA.
  • Колонка должна быть по возможности широкой и короткой. Чем шире и короче колонка, тем быстрее скорость течения жидкости, а разделять хроматографические зоны при адсорбционной хроматографии не требуется.
  • п.8.

  • Этот нагрев денатурирует RNA, устраняя возможные двухцепочечные участки, которые могут сделать polyA-хвост недоступным.
  • п.9.

  • Если раствор будет слишком холодным, SDS из CLB выпадет в осадок в п. 11. растворить его в колонке чрезвычайно сложно. Придётся ее разбирать, нагревать суспензию oligo(dT) cellulose в большом объеме H2O и перенабивать колонку заново.
  • п.11.

  • В некоторых методиках рекомендуется повторно наносить материал на колонку. Судя по нашему опыту это необязательно (в случае, когда использовалась 0.1g oligo(dT) cellulose и получено 30µg poly(A)+RNA нанесение элюата на колонку во второй раз не дало дополнительного связывания. (Т.е., когда нанесли на отдельную колонку то, что не связалось в первый раз, то при элюции пика не было.) Однако, нельзя исключить, что наш результат определялся высоким качеством используемой oligo(dT) cellulose (Type 7, Pharmacia).
  • Элюат можно собрать и приготовить из него рибосомный маркер молекулярного веса.
  • п.12.

  • Не надо ставить перед собой задачу отмывать до тех пор, пока спектрофотометр не перестанет детектировать пик RNA. В любом случае при одном раунде очистки на колонке останется масса рибосомной RNA, приблизительно равная массе mRNA (они как-то стехиометрически ассоциируют друг с другом).
  • Например, пусть на 0.1g колонке чистится ~ 2.5mg тотальной RNA. Ожидаемый выход mRNA составляет ~25-100µg. Приблизительно столько же будет и рибосомной RNA. Все это будет элюировано в объеме <0.7ml. Таким образом, нас устроит такая концентрация "C" примесей, что
  • 0.7[ml]xC<<25-100µg => C<<30µg/ml, т.е. OD260(элюируемого раствора) <<1.

    п. 13.

    Колонка с медным теплообменником
  • На колонке с медным нагревателем оптимальное время подогрева 5' (при температуре воды в нагревателе 70oC);
  • На рис. изображена колонка с подогревом. Вся конструкция скрепляется зажимом для бумаги - "бульдог" одетым на "шубу" из фольги.
  • п. 14.

  • Предварительный (до элюции) прогрев колонки и элюция горячим буфером приводят к тому, что RNA сходит пиком ширины ~1Vcolumn, а не растягивается на ~5Vcolumn (Для 0.5ml колонки при сборе фракций по 8-10 капель (~150 µl), polyA+RNA находится во 2-4 (реже в 5) пробирках. Достаточно снять ~7 пробирок.)
  • Фракции собираются:

    1. 9 капель
    2. 10
    3. 10
    4. 10
    5. 4 (на случай, если что-то попадет в 5юфракцию, чтобы не брать слишком много дополнительного материала)
    6. 10
    7. 10.

    п.15.

  • По 1 µl из каждой фракции к 100µl EB - измерять OD260на спектрофотометре.
  • п.24.

  • При высоком рН двухцепочечные нуклеиновые кислоты денатурируют. Такая отмывка гарантирует, что все, что способно гибридизоваться с oligo(dT) будет смыто с колонки.


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


    Дополнения, комментарии, вопросы





       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler