Главная страница MolBiol.ru > Методы > RNA > Формальдегидный форез - Northern Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Формальдегидный форез RNA - Northern

 

    Форез

  1. (не обязательно) проверить, что pH формальдегида >4.0;
  2. расплавить соответствующее количество агарозы в H2O, лишь затем добавить 50xFGRB и формальдегид:
  3. Конц.Сток 100ml 140ml 280ml
    агароза 1% тв. 1.0g 1.4g 2.8g
    H2O   mQ 80.4ml 112.6ml 225.1ml
    50xFGRB 1x 50x 2.0ml
    2.21g
    2.8ml
    3.09g
    5.6ml
    6.18g

    Формальдегид
    Mw=30.03
    2.2M 36.5%
    13.2M
    16.6ml
    18.1g
    23.2ml
    25.3g
    46.5ml
    50.7g

  4. охладить до <60oС, залить гель под тягой;
  5. приготовить форезный аппарат:
  6. Формальдегидный форез РНК

  7. приготовить RNA, смешав из расчёта:
  8. RNA (в H2O) => 3µl
    "RNA loading mix" => 7µl;

  9. 65oС 15', сразу в лёд на 2-5';
  10. к каждому образцу добавить 1/10V "RNA gel buffer";
  11. префорез 5' ~5V/cm, нанести образцы, форез в тех же условиях;


  12. Перенос

  13. частично отмыть гель от формальдегида в H2O (в ~300ml 30');
  14. уравновесить в 20xSSC (в ~300ml 30');
  15. поставить перенос в этом же SSC;
  16. зафиксировать RNA на мембране UV (хранить завёрнутой в SaranWrap при -20oС);


  17. Гибридизация

  18. предгибридизация в HSB(f+) 50oС, ~30';
  19. гибридизация 50oС, ON (для гибридизации использовать тот же буфер, что использовался для предгибридизации, добавив в него меченный зонд);
  20. Отмывка

  21. (I) 2х 15', NT-68oC
  22. Конц.Сток1L
    SSC1x20x50ml
    SDS0.1%10%10ml
    H2O mQ940ml
  23. (II) 2х 20-25', 68oC
  24. Конц.Сток1L
    SSC0.1x20x5ml
    SDS0.1%10%10ml
    H2O mQ985ml


    Отшпаривание

  25. после экспозиции отшпарить метку в кипящем 0.5% SDS (довести 0.5% SDS до кипения, погрузить в кипящий раствор мембрану, кипятить 0.5-1'; оставить при NT на качалке на 20-30'. Затем - дать стечь жидкости, завернуть в SaranWrap (хорошо бы провести контрольную экспозицию) и хранить при -20oС.)


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 12649

    Растворы

    FGRB

    50x (formaldehyde gel-running buffer), p=1.104g/ml (хранить при +4oС):

    Конц.Сток0.5L1.0L2.0L
    MOPS (pH7.0)1.0M209.27g/M104.64g209.27g418.54g
    AcONax3H2O0.5M136.08g/M34.02g68.04g136.08g
    EDTAx2H2O50mM372.3g/M9.31g18.62g37.23g
    H2O mQ404.0ml808ml1616ml
    Конц.Сток0.5L1.0L2.0L
    MOPS (pH7.0)1.0M209.27g/M104.64g209.27g418.54g
    AcONa anhydrous 82.04g/M20.51g41.02g82.04g
    EDTA x 2H2O50mM372.3g/M9.31g18.62g37.23g
    H2O  417.5ml835ml1670ml
    • Довести до pH7.0 10N NaOH (на 500ml буфера ~22ml), фильтровать через 0.22µm фильтр.
    • На свету (в процессе хранения) желтеет, но это не сказывается на его качестве.

    RNA gel buffer

    (хранить при -20oС):

    Конц.Сток10ml50ml
    Глицерол50%100%5.0ml
    6.31g
    25ml
    31.53g

    EDTA1mM0.5M20µl0.1ml
    БромФен. синий0.1%тв.10mg0.05g
    Ксиленцианол0.1%тв.10mg0.05g
    H2O mQ4.96ml24.8ml

    RNA loading mix

    (хранить при -20 - -70oС):

    одно
    нанесение
    100µl1.5ml10ml
    50x FGRB0.2µl2.9µl43.1µl287µl
    формальдегид (12.3M)1.75µl25.1µl377µl2.51ml
    формамид (100%)5.0µl71.8µl1.08ml7.18ml
    EtBr
    (10µg/µl)
    образец0.01µl0.14µl2.1µl14µl
    маркер0.1µl1.4µl21µl140µl

    HSB (f+)

    high SDS hybridization buffer(хранить основной сток при 4oС, рабочий - NT)

    Конц.Сток500ml
    SDS7%тв.35g
    Formamid50%100%250ml
    283.3g

    SSC5x20x125ml
    145.3g

    Bloc. Reagent2%тв.10g
    NaP (pH 7.0)50mM1M25ml
    27.6g

    N-Lauroylsarcosine Na0.1%10%5ml
    5.1g

    Salm.Sperm DNA50µg/ml10µg/µl2.5ml
    H2O mQ49ml

    p=1.111

    • вместо 2% Blocking Reagent ("Roche Diagnostics GmBH; бывший Boehringer Mannheim"
      #1 096 176) можно использовать 10x Denhardt или сухое обезжиренное молоко.
    • Blocking Reagent можно растворить, лишь в буфере с высокой ионной силой (в данном случае - в H2O+SSC+NaP).
    • Salmon sperm DNA должна быть раздробленной и денатурированной.



Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/



    Комментарии

    По пунктам

    п. 1.

  • Про pH формальдегида написано во всех методиках, однако, мы вполне успешно пользовались формальдегидом с pH в районе 4.0.
  • п. 2, 3.

  • Делать это надо под тягой: пары формальдегида весьма и весьма неприятны.
  • п. 4.

  • Лучше использовать для Нозернов отдельную камеру. В этом случае ее достаточно сполоснуть водой перед электрофорезом. Если камера грязная или из ненадежного источника, надо вымыть детергентом, сполоснуть mQ, сполоснуть ~ 15-30' 2% H2O2(~10') и затем вновь сполоснуть mQ.
  • Форез проводят так, чтобы форезный буфер не попадал на верхнюю поверхность геля. В противном случае формальдегид будет диффундировать из геля, возникнет неоднородность его концентрации по толщине геля, => полосы RNA будут наклоняться, а при переносе - расширяться. SaranWrap используют для того, чтобы поверхность геля не подсыхала во время фореза.
  • п. 5.

  • Нужно помнить, что существует два различных "RNA loading mix" - для маркера и для образцов. Концентрация EtBr в RNA loading mix для маркера увеличена в 10 раз, это позволяет наблюдать 8 полос при суммарной массе 0.2µg. Делать такую же концентрацию в буфере для образца нельзя, т.к. высокая концентрация EtBr снижает эффективность гибридизации.
  • Смесь с "RNA loading mix" можно хранить неограниченное время при -70oС.
  • п. 6.

  • Денатурация возможных двухцепочечных структур в RNA и химическое взаимодействие RNA с формальдегидом. Вторая реакция (в отличие от первой) требует вполне заметного времени, так что сокращать указанные в методике 15' не стоит. Быстрое охлаждение до 0oС имеет следующий смысл. Для образования двухцепочечной структуры требуется некая начальная "энергия активации". При 0oС молекуле сложнее раздобыть эту энергию. Таким образом, хотя двухцепочечная структура тем более стабильна, чем ниже температура, образоваться при 0oС она не может.
  • п. 8.

  • Если интересует mRNA "всех" размеров, то форез проводить до тех пор, пока бромфеноловый синий не дойдёт приблизительно до 4/5 геля (он идёт в районе ~100b RNA).
  • Можно ориентироваться по размерам рибосомной RNA.
  • п. 11.

  • Лучше использовать нейлоновую мембрану. Нейтральную или положительно заряженную (Hybond N или Hybond N+) - всё равно.
  • п. 13.

  • Очень важно, чтобы мембрана оставалась влажной с п.13 по п.17. Особенно легко подсушить мембрану во время экспозиции, поэтому мы рекомендуем всегда проводить экспозицию при -20 - -70oС.
  • п. 15.

  • Отмывку (I) можно проводить при любой температуре от NT до 680C.
  • п. 16.

  • Для горячей отмывки (II) мало поместить стакан с мембраной в горячий гибридайзер. Раствор для отмывки нужно заранее довести до 680C и заливать в стакан уже горячим (лучше заливать в два приёма – первой порцией сполоснуть гибридизационный стакан от старого буфера и одновременно подогреть его, а второй порцией отмывать мембрану указанное время).
  • п. 17.

  • Осторожно!, 0.5% SDS может резко вскипеть.

    Дополнения, комментарии, вопросы





       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler