Главная страница MolBiol.ru > Методы > Библиотеки > Геномная библиотека Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Приготовление геномной библиотеки

 

    Проверка качества DNA

  1. форез в 0.3% агарозе (лучше в холодной комнате). Маркер - лигированный на себя фаг лямбда. Подходящая для конструирования библиотеки DNA должна идти достаточно компактным бэндом выше ~100kbp. Шмера быть не должно.


  2. Аналитический недорестрикт

  3. приготовить 9 пробирок "N1"-"N9" в бане 0oС (из расчета ~0.75µg ДНК на пробирку); общая смесь 166.7µl (7.5µg DNA в 1х "M" рестрикционном буфере), разаликвотить:
  4. N1=30µl,
    N2=15µl,
    ..............
    N9=15µl,
    N10=15µl;

  5. рестриктазу Sau 3A развести до концентрации 0.5u/µl в 1х "M" буфере (V~5µl);
  6. добавить к "N1" 4µl разведённого фермента, пипетировать ~10 раз обрезанным желтым типом. 1/2 материала перенести в следующую пробирку, следующий шаг - новым типом и т.д. в 10ю пробирку ничего переносить не надо, она будет служить контролем "без рестриктазы" (9 пробирок обрабатываются за ~10');
  7. 37oС, 1h, слегка помешивая каждые 10-15';
  8. + 1.5µl буфера для внесения SDS(+);
  9. форез (0.3% агароза) (лучше в холодной комнате);
  10. рассчитать концентрацию фермента, при которой максимальное количество DNA имеет длину 14-24kbp.


  11. Препаративный недорестрикт

  12. препаративная рестрикция 3х по 100µg DNA резать в условиях
  13. "1" - 3х кратная оптимальная концентрация рестриктазы,
    "2" - 1х,
    "3" - 1/3х

  14. форез - контроль каждой фракции; если рестрикция прошла удачно - объединить, если "промахнулись" - взять только удачные; поставить дополнительные (уже скорректированные) препаративные рестрикции.


  15. Фракционирование ДНК

  16. в пробирке ротора SW40 приготовить градиент
  17. 25->5% NaCl (w/v)
    3mM EDTA, pH 8.0;

  18. наслоить DNA в объеме <200µl (но не более 150µg);
  19. ЦФ 37 krpm NT, 4.5h; разгонять при низком ускорении, останавливать центрифугу в режиме без торможения;
  20. перенести фракции по 250µl в пробирки с 1.25ml 77% EtOH;
  21. >1h, -20oC;
  22. ЦФ NT, 10';
  23. осадок дважды промыть охлаждённым 70% EtOH;
  24. 1/20 материала на форез (0.3% агароза), выбрать пробирки, содержащие фрагменты DNA длиной 14-24kbp (нужный диапазон размеров обычно находится в районе 14-16ойпробирок);
  25. объединить содержимое нужных пробирок;
  26. определить концентрацию, упаковать аликвоту;
  27. определить титр библиотеки (высеяв 1µl, 10-2µl, 10-4µl);
  28. добавить DMSO до 7%, разаликвотить в подписанные пробирки по 105pfu (для дрозофилы), хранить при –70oС.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 12216

    Растворы

    NE-5

    (хранить при NT).

    Конц.Сток10ml50ml150ml200ml
    NaCl5%(w/v)
    0.856M
    5M1.71ml
    2.03g
    8.56ml
    10.15g
    25.68ml
    30.45g
    34.22ml
    40.59g

    EDTA3mM0.5M60µl300µl0.90ml1.20ml
    H2O mQ8.23ml41.15ml123.44ml164.58ml

    p=1.1032.

    NE-25

    (хранить при NT).

    Конц.Сток10ml50ml150ml200ml
    NaCl25%(w/v)
    4.27M
    5M8.56ml
    10.15g
    42.78ml
    50.73g
    128.34ml
    152.19g
    171.12ml
    202.93g

    EDTA3mM0.5M60µl300µl0.90ml1.20ml
    H2O mQ1.384ml6.92ml20.76ml27.68ml

    p=1.16.




Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/



    Комментарии

    Общие

  • Оценить необходимый размер библиотеки для известного размера генома (см. "Свойства и состав живых организмов.") можно по формуле:
  • N = ln(1-p)/ln(1-lфр/L), где

    N – размер библиотеки;
    p – вероятность, что уникальный фрагмент будет присутствовать в библиотеке;
    lфр – средний размер клонируемого фрагмента;
    L – размер гаплоидного генома.

    Для дрозофилы при клонировании в фаге лямбда: lфр=1.5x104bp; L=1.4x108bp =>

    N=-9.3х103ln(1-p)

    p0.750.90.9990.99999
    N (x104)1.22.16.410.7
  • Среднее количество клонов, которое получается при скрининге библиотеки "точечным" зондом: n = N lфр/ L; для дрозофилы: n ~10-4N.
  • Нужно иметь в виду, что представленные выше вероятности рассчитывались в предположении, что "Sau3A недорез" происходит равномерно. В реальном геноме имеются участки аномально высокой и аномально низкой плотностью Sau3A сайтов.


  • По пунктам

    п. 1.

  • На качестве фореза (особенно при такой низкой концентрации агарозы) может сильно сказаться "перегруженность" ячейки, поэтому имеет смысл гнать несколько дорожек с разным количеством DNA.
  • Особенности работы с низкопроцентными (0.3%) гелями:
    1. в плашку для электрофореза залить "подложку" - слой агарозы 1.5-2.0% толщиной ~2-3 mm, дать застыть;
    2. на этой подложке закрепить гребенку так, чтобы между зубцами и подложкой было расстояние 1-2mm;
    3. залить 0.3% агарозу (лучше в холодной комнате);
    4. гребенку удалять только под слоем буфера, иначе ячейки слипнутся.

    ВНИМАНИЕ! Работать в холодной комнате. Гель очень хрупкий, все манипуляции проводить только вместе с 2% подложкой; не лить буфер на поверхность геля.

    п. 2-8.

  • В этом разделе определяется количество Sau3A, которое за 1h при 37oС дает максимальное количество фрагментов в диапазоне 14-20kbp’s. Для ориентировки - у нас получалось ~0.015-0.03u на 0.75µl DNA.
  • п. 2.

  • 0oС - чтобы рестрикция в различных пробирках шла одно и то же время.
  • п. 4.

  • Приготовление двукратных разведений фермента. Геномная DNA весьма вязкая, хорошо перемешать фермент непросто. В то же время, если смешивать слишком интенсивно, можно раздробить DNA. Разумный компромисс - смешивать и в начале и в ходе инкубации на 37oС)
  • п. 6.

  • Остановка рестрикции. Буфер для внесения не должен содержать ксиленцианол, иначе он, находясь в пределах 14-20kb, будет мешать анализу.
  • п. 9.

  • Сайты рестриктазы Sau3A расположены в среднем через 250bp. Однако, существуют зоны, где их аномально много или аномально мало. Чтобы такие зоны не избежали клонирования, применяются рестрикции с заниженной (соответственно - завышенной) концентрацией рестриктазы.
  • Стоит обратить внимание, что равномерно смешать фермент с DNA трудно, поэтому вначале нужно развести необходимое количество фермента в 1х М буфере в объеме ~ 1/5 суммарного объема рестрикции и только затем смешивать его с DNA. Стоит дополнительно помешивать пробирку во время инкубации на 37oС каждые 10-15'.
  • п. 10.

  • Обычно оказывается, что рестриктазы взято больше, чем нужно и приходится ставить реакцию "1/3" в новых условиях (вполне вероятно, что стоит сразу ставить четыре рестрикции).
  • п. 11.

  • Импортные мешалка и перистальтический насос (иначе раствор будет идти толчками), не забыть предварительно протолкнуть воздушный пузырек в смесителе.
  • Мы предпочитаем наслаивать градиент сверху. Чтобы не нарушать градиент, можно положить в пробирку маленький кусочек пробки и наносить раствор на него.
  • Смешиваемые растворы имеют различную плотность, поэтому равные объёмы в смеситель не нальёшь. Если вы хотите, чтобы после открывания крана смесителя растворы остались в равновесии, надо наливать (для ультрацентрифужной пробирки объёмом Vo):
  • V25 = Vo/(1+p25/p5) = 0.471Vo = 5.65ml для Vo = 12ml
    V5 = Vo/(1+p5/p25) = 0.529Vo = 6.35ml для Vo = 12ml



    Vo = ; V25 = , V5 =

    п. 13.

  • Уравновешивать пробирки, добавляя 1х М буфер.
  • п. 18.

  • Осаждать (и анализировать) можно не все фракции, а через одну (две).
  • п. 20.

  • Мы проводим упаковку следующим образом:
    1. заранее подготовить клетки;
    2. утром упаковать DNA;
    3. высеять 10х разведения для определения титра библиотеки;
    4. через 6-7h, когда появятся фаговые бляшки, рассчитать титр;
    5. к остаткам библиотеки добавить DMSO до 7%, расфасовать по 106pfu аликвотам (для дрозофилы), подписать и заморозить (весьма распространенно беспокойство по поводу качества DMSO, длительное время хранившегося при NT. Мы убеждены, что, если речь идет о хранении замороженных клеток, то беспокоится не о чем).
    6. высеять необходимое количество;

    п. 22.

  • Не надо откладывать заморозку библиотеки. Через неделю титр может упасть раз в десять.
  • Подписывать аликвоты (вектор, источник библиотеки, дата, титр) надо очень аккуратно, т.к. хорошая библиотека может пригодится и через год и через 5 лет.

    Дополнения, комментарии, вопросы





       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler