Главная страница MolBiol.ru > Методы > Библиотеки > Анализ клонов после первичного скрининга Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

PCR-гибридизация первичного скрининга библиотеки

PCR-гибридизация после первичного скрининга позволяет:
а) отличить истинно-позитивные сигналы от ложно-позитивных,
б) оценить размер вставки индивидуальных клонов.
  1. выколоть зоны локализации сигналов;
  2. перенести их в 1.7ml микроцентрифужные пробирки, с SM/хлороформ = 500 µl/20 µl;
  3. элюция фага 2h на качалке 37oС или в холодильнике ON (суспензию фага хранить при 4oС);
  4. PCR амплификация в объёме 15 µl:
  5. суспензию фага из п.3 ЦФ 5' NT;
  6. в каждую PCR-пробирку добавить по 1 µl суспензии фага;
  7. параметры PCR:
  8. I. Td = 95oC, => 1';
    II. 28 циклов:

    Td = 94oC, => 10'';
    Ta = 48.5oC, => 25''
    Te = 68oC, => 3-6';

    III. T = 4oC;

  9. нанести PCR-реакции на 1% агарозный гель;
  10. Саузерн-блот;
  11. гибридизация.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 8469

    Растворы

    Стоковый PCR-mix.

    Конц.Сток100µl
    Буфер 10х10µl
    MgCl22.5mM25mM10µl
    dNTP’s 200µM10mM2µl
    Primer T3&T70.1µM10µM1+1µl
    Taq/Pfu pol mix0.05u/µl5u/µl1µl
    Буфер для внесения20µl
    H2O mQ55µl


    Комментарии

    По пунктам

    п. 4

  • Использованные нами праймеры:
  • #T320bATTAACCCTCACTAAAGGGA
    #T720bTAATACGACTCACTATAGGG

    п. 6

  • Хлороформ не оказывает никакого влияния на PCR-реакцию.
  • 5х буфер для внесения позволяет сразу же вносить PCR реакции в лунки геля.
  • Состав буферов, относящихся к PCR смотри в "Состав PCR реакции".
  • п. 7

  • Время на этапе элонгации зависит от ожидаемой длины cDNA.
  • п. 10

  • Для гибридизации можно использовать тот же буфер, который уже был применён для первичного скрининга (предгибридизация в новом буфере, затем его слить и залить старый гибридизационный буфер, предварительно прогретый 3' в кипящей бане).

    Дополнения, комментарии, вопросы





       


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler