Главная страница MolBiol.ru > Методы > Белки > SDS PAAG Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

PAAG электрофорез белков

 

    Выбор % разрешающего геля

    Размер белка, kDa%AA
    36-2055%
    24-2057.5%
    14-20510%
    14-6612.5%
    10-4515%


    Подготовка форезного аппарата

  1. вымыть камеры детергентом, хорошо сполоснуть;
  2. мыть стекла детергентом (если очень грязные или из сомнительного источника - хромпиком); если хочется, чтобы гель легко снимался со стекол - силиконизировать (достаточно 1 раз на ~10 прогонов);
  3. Дегазирование геля
  4. оценить объем геля:
  5. гель: камера:
    минимиди
    концентр.~2ml~4ml
    разреш.~10ml~15ml
  6. приготовить нижний/разрешающий гель (без TEMED);
  7. Заливка геля
  8. дегазировать ~10', во время дегазации заняться форезным прибором:
  9. * собрать форезный прибор, отметить фломастером уровень концентрирующего геля (длина зубчиков гребенки + 1сm);
    * ~5-10ml расплавленной 1.5% агарозы (в GTB-буфере) налить на ровную горизонтальную поверхность. Сразу же установить прибор со стеклами (агароза поднимется между стеклами на ~2-10mm).
    * "пролить" агарозой внешние края спейсеров;

  10. залить разрешающий гель до отметки;
  11. наслоить сверху бутанол (~3-10mm);
  12. во время полимеризации дегазировать концентрирующий гель;
  13. после завершения полимеризации отсосать бутанол, 2-3 раза сполоснуть получившийся карман дистиллированной водой, отсосать остатки вытянутым типом;
  14. вставить (не полностью) гребенку между стеклами;
  15. залить концентрирующий гель, вставить полностью гребёнку;
  16. после полимеризации установить верхнюю камеру в нижнюю, залить буфер, вытащить гребенку;
  17. немедленно промыть лунки шприцом, поправить изогнувшиеся перегородки между карманами (либо плоским типом, либо иглой шприца);


  18. Форез

  19. материал + буфер для нанесения, смешать, перед форезом прокипятить 5';
  20. перед нанесением промыть лунки шприцом;
  21. гнать при напряжении (для мини- и миди-камеры) ~10V/cm в концентрирующем геле, ~180V в разрешающем.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 91276

    Растворы

    TGB

    Tris-Glycine buffer 5x, pH8.3, (хранить основной сток при+4oС, рабочий сток - приNT).

    1x5xСток1L1.5L
    Tris-base25mM125mM121.1g/M15.1g22.71g
    Glycine250mM1.25M75.05g/M94g141g
    SDS0.1%0.5%10%50ml75ml
    H2O  mQ   

    Разрешающий гель

       (готовить непосредственно перед применением)


    10ml
    5%6%7.5%10%12.5%15%
    AA, 30%1.666ml
    2.0ml
    2.5ml
    3.33ml
    4.16ml
    5.0ml
    H2O, mQ4.384ml
    4.05ml
    3.55ml
    2.72ml
    1.89ml
    1.05ml

     Конц.Сток10ml  
    Tris-Cl pH 8.8375mM1M3.75ml  
    SDS0.1%10%0.1ml  
    PSA0.1%10%0.1ml  
    TEMED0.08%100%8µl  

    Концентрирующий гель

    (готовить непосредственно перед применением):

    Конц.Сток1ml2ml3ml4ml5ml
    H2O mQ0.68ml1.4ml2.1ml2.7ml3.4ml
    AA5%30%0.17ml0.33ml0.5ml0.67ml0.83ml
    TrisxCl pH6.80.13M1M0.13ml0.25ml0.38ml0.5ml0.63ml
    SDS0.1%10%10µl20µl30µl40µl50µl
    PSA0.1%10%10µl20µl30µl40µl50µl
    TEMED1µl/ml 1µl2µl3µ14µl5µl

    30% AA

    (стоковый раствор: АА:BIS=29:1(хранить при+4oС, можно несколько месяцев).

    Конц.Сток100ml150ml200ml
    AA29% (w/v)тв.29g43.5g58.0g
    BIS1% (w/v)тв.1g1.5g2.0g
    H2O mQ    

    2x SDS- gel loading buffer

    (готовить без DTT, хранить при NT; DTT добавлять в аликвоту, которую хранить при +4oС и использовать в течение месяца):

    Конц.Сток10ml
    Tris-HCl (pH 6.8)50mM1M0.5ml
    Dithiothreitol100mM1M1.0ml
    SDS2%10%2.0ml
    Bromphenol blue*0.1%~100х0.1ml
    Glycerol10%100%1.0ml
    1.25g

    H2O mQ5.4ml
  • можно готовить и 4х;
  • 4x SDS- gel loading buffer with b-MeEtOH

    Нельзя использовать при серебряном окрашивании.
    (Готовить без b-MeEtOH, хранить при NT; b-MeEtOHд обавлять в аликвоту, которую хранить при +4oС и использовать в течение месяца)

    Конц.Сток10ml
    Tris-HCl (pH 6.8)200mM1M2.0ml
    b-MeEtOH400mM14.5M280 µl
    SDS4%10%4.0ml
    Bromphenol blue*~0.01%~100х0.1ml
    Glycerol40%100%4.0ml
    5.0g

  • мы добавляем совсем немного бромфенолового синего. Он нужен лишь для того, чтобы: (i) видеть образец в лунке, (ii) видеть положение фронта фореза. Количества, которые обычно приводятся в методиках дают слишком жирную полосу, которая даже мешает окрашиванию.



Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/



    Комментарии

    Общие

  • Разрешающий и концентрирующий гели имеют различные буфера, поэтому залитый гель нехорошо долго хранить. Если требуется гель очень высокого качества, то можно оставить ON на +4oС, не вынимая гребёнку и замотав верх и низ SaranWrap, чтобы не подсыхал. Если качество требуется умеренное (рутинный анализ), гель на +4oС можно хранить ~месяц.
  • Бромфеноловый синий идёт с фронтом фореза. Ниже него белков нет.
  • Опасно наносить на форез белок в высокой концентрации соли: 1) K+ (и некоторые другие катионы) способны выпадать в осадок с белком и SDS, 2) высокая соль не позволяет белкам войти в гель. Однако, часто концентрирующий гель способен обеспечить хорошую картинку даже если вначале в ячейке выпал осадок.
  • В случае бактериальной культуры средней плотности на одну лунку PAAG 0.75х2.5mm2 нужно брать материал из ~15 µl бактериальной культуры.
  • Дополнение от Маши: Чтобы ускорить процесс полимеризации, можно пластины с залитым гелем поставить в термостат с 37-60OC по Цельсию (или направить на них струю горячего воздуха от обогревателя). Это можно сделать после 10-15' после начала полимеризации. Реакция полимеризации идёт по свободно-радикальному механизму, поэтому она при повышении температуры ускоряется (несмотря на то, что экзотермическая).
  • По пунктам

    п. 0.

  • Вполне можно пользоваться и промежуточными концентрациями.
  • п.4.

  • Дополнение:
    Удобно приготовить раствор ПААГ (все, кроме персульфата аммония и ТЕМЕD) и отливать для заливки по мере надобности. Хранится такой сток два-три месяца совершенно спокойно.
  • п.5.

  • Кислород - ингибитор полимеризации. Без дегазации гель, конечно, заполимеризуется, но за большее время (в этом случае стоит увеличить раза в полтора количество PSA и TEMED).
  • п.6.

  • Удобно отлить из остатков гелевого раствора ~0.5 -1.0ml в 1.7ml пробирку и использовать ее как индикатор полимеризации.
  • п. 9.

  • Можно промакнуть сложенной фильтровалкой.
  • п. 10.

  • Вставлять гребенку после заливки геля - ненужная суета во время полимеризации, кроме того она выдавит в камеру значительный объём геля.


  • Дополнения от людей знающих

  • Житков М.Ю., ЦНИИС, Москва.
    1. Очень удобны градиенты концентрации акриламида - их можно делать квазиступенчатыми. Для этого готовим 2 раствора - с наибольшей и наименьшей концентрацией, затем делаем 5-7 смешаных растворов и заливаем в камеру. Не надо тщательно насливать, растворы должны частично смешиваться! После полной заливки хорошо слегка помешать проволочкой, но не переусердствовать. Остаточная ступенчатость не влияет на качество разделения. Если она все же велика (вы очень тщательно наслаивали растворы), то обычно на геле видны "ступеньки". Такой гель можно выбросить.
    2. Я предпочитаю фотополимеризацию с рибофлавином для всех акриламидных гелей. Удобство - готовые смеси можно какое-то время и подержать (в темноте) и для ВСЕХ разгонок используется один раствор инициатора.

    Дополнения, комментарии, вопросы

    Fibrinolysis /12.12.2005 13:24/
    Хотелось бы уточнить для тех кто делает в первый раз, что pH пятикратного TGB доводить до 8.3 не нужно!



    Fibrinolysis /12.12.2005 15:10/
    В классической работе Лэмли (Laemli,U.K., Nature,227, 680 (1970))
    1x TGB = 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0,1% SDS pH=8,3



    0xy /12.12.2005 15:22/
    Laemmli, U.K.



    atv /13.12.2005 03:26/
    А вот вразумите всё-таки, можно ли сделать готовый раствор для геля (т.е. всё кроме APS+TEMED) и его хранить (в холодильнике, например)? И как долго?



    Batareykin /13.12.2005 08:23/
    (atv @ 13.12.2005 00:26)
    Ссылка на исходное сообщение  А вот вразумите всё-таки, можно ли сделать готовый раствор для геля (т.е. всё кроме APS+TEMED) и его хранить (в холодильнике, например)? И как долго?


    конечно, можно.
    Я для своих целей и 15 % разделяющего, и концентрирующий так держу в холодильнике.

    только долго хранить его не стоит (более 1 года smile.gif ) - протухаеть...



    Batareykin /13.12.2005 08:24/
    (Forum_robot @ 12.12.2005 10:24)
    Ссылка на исходное сообщение  <strong><font color='#800000'>Комментарии к постоянной странице сайта</font>: PAAG электрофорез белков ( http://www.molbiol.ru/protocol/17_01.html#add )</strong>

    Приготовление полиакриламидного геля и электрофорез белков. Выбор % разрешающего геля. Подготовка форезного аппарата. Форез. Хранение гелей.


    бедный робот...



    _a_jadan_ /11.01.2006 20:00/
    к п 5,8 дегазировать можно как вакуумом, так и продувкой азотом, или инертными газами (гелий), главное избавиться от кислорода, причем продувка быстрее и эффективнее, пузырек с раствором закрывается резиновой пробкой с двумя иголками, конец одной на дно, другой под крышкой, к длинной игле камеру (от мяча, шарик) с азотом (или балон, через редуктор) поток - чтоб еле булькало. (несколько минут и готово) не нужен ни насос, ни мешалка.



    _Pedro77_ /11.01.2006 21:10/
    Чтоб избежать размывки трэков при внесении проб с высоким содержанием соли либо с ПАВ, полезно с двух боков в лунки нанести чистый буфер для образцов (который добавляли в пробы перед кипячением). Часто это помогает получить более-менее не размытую картинку.



    _Dascha_ /11.01.2006 21:37/
    Собственно, готовые SDS-гели можно хранить и при комнатной температуре, предварительно поместив во что-то влажное, например, фильтровальную бумагу, и не давать им высыхать. ДТТ мы храним на -20 сколько угодно, и он не портится.
    Например в Германии 10% персульфат аммония принято в виде раствора хранить в морозильнике, хотя принято делать его всегда свежим. Но, видимо, немецкая практика оправдана, потому что гели получаются, сама их заливала.



    Гость /11.01.2006 21:47/
    Уважаемые есть еще такой момент что уж еще раз вспоминая Остермана хочу отметить что ПСА лучше добавлять в растворгеля в последнюю очередь.А с рибофлавином такая штука , он конечно хорош, но летом в холодной лаборатории без света полимеризация занимает гораздо большее время с ним чем с ПСА. И еще просьба вы пишете про выбор концентрации гелей относительно массы белка. Будет лучше если вы еще напишете список этих самых белков с их массами. начинающим будет удобней.



    comp3v /15.01.2006 03:01/
    хм... а мы вот 10% APS и вовсе на +4 храним, и довольно долго - работает без проблем.



    Николай Полянский /20.02.2006 14:49/
    Коллеги, хотелось бы знать, м.б. кто-нибудь имел дело с разделением водонерастворимых белков. Проблема такая - образец белков, растворенных в мочевине и тиомочевине и после соответственно кипячения в синем буфере и разделения дает очень расплывчатую картину. Много хуже картины водорастворимых белков. В сам буфер мочевину не добавляю.



    ммм /20.02.2006 15:15/
    2 Николай Полянский.

    Общая рекомендация такая. Мочевину и ее тио подругу из раствора удалить начисто(например диализом), белки конечно в осадок выпадут, но это не должно вас пугать. Сей осадок надо собрать и как следует покипятить в "синем буфере", белки конечно полностью не растворятся, но львиная их доля растворится, пробу надо отцентрифуговать и отобрать супер его и использовать как пробу.

    PS мочевина мешает связыванию SDS с белком, и когда белки выходят из мочевины в SDS то часть из них выпадает в осадок(особенно, если белки сильно нерастворимые и в высокой концентрации) и получаются хвосты.



    Garry /20.02.2006 16:16/
    Полянскому Н. > Мы занимаемся анализом гибридности семян (кукурузы, подсолнечника, ячменя ....). Короче почти все объекты - проламины, за исключением гелиантина подсолнечника. Так вот, если SDS электрофорез не является для Вас критичным, то мы проводим электрофорез в среде таких детергентов как мочевина. Она входит и в состав буфера для растворения и в состав геля. Результаты получаются очень неплохие. Если нужно подробнее, то пишите мне на мейл.



    Гость /22.02.2006 11:02/
    Спасибо. Очевидно, попробую оба варианта.



    Guest /22.02.2006 12:33/
    To: Garry
    Мочевина - НЕ ДЕТЕРГЕНТ (т.е. не является "омыляющим" веществом, способным образовывать мицеллы в растворе), а ХАОТРОПНЫЙ АГЕНТ.



    Гость /01.06.2006 12:49/
    Уважаемые коллеги! Поделитесь опытом извлечения белка из ПААГ блока или его фрагментов так, чтобы можно было посчитать С14-радиоактивность в полосках белков (разумеется, они будут вырезаны)

    Заранее благодарим.
    С наилучшими пожеланиями,
    snz@post.nsu.ru



    comp3v /03.06.2006 18:03/
    а вот такой вопрос возник. У меня есть лизаты в гуанидиновом буфере (6M GuaCl, для последующей очистки на Ni-резине), и в идеале хотелось бы аликвоту оттуда брать на вестерн. Брать "прямо так" - однозначно не получается (при миграции получается жуть, тем более что наносить приходится довольно много, поскольку белок сильно разбавлен). Но я вот тут почитал, что некоторые мочевину добавляют прямо при приготовлении геля, и подумал - а нельзя ли такое же и с гуанидином сделать? то бишь, добавить его в сам гель... или это совсем дурная идея?



    Tom1 /04.06.2006 02:57/
    проще взять аликвоту и высадить тху.....



    bukach /05.06.2006 18:40/
    (comp3v @ 03.06.2006 19:03)
    Ссылка на исходное сообщение  а вот такой вопрос возник. У меня есть лизаты в гуанидиновом буфере (6M GuaCl, для последующей очистки на Ni-резине), и в идеале хотелось бы аликвоту оттуда брать на вестерн. Брать "прямо так" - однозначно не получается (при миграции получается жуть, тем более что наносить приходится довольно много, поскольку белок сильно разбавлен). Но я вот тут почитал, что некоторые мочевину добавляют прямо при приготовлении геля, и подумал - а нельзя ли такое же и с гуанидином сделать? то бишь, добавить его в сам гель... или это совсем дурная идея?


    yes.gif совсем. гуанидин, в отличие от мочевины, заряжен.



    comp3v /05.06.2006 18:50/
    ну да, я просто как-то раз наткнулся на протокол, где его добавляли - в небольших количествах, но гнать потом приходилось на очень маленьком токе.

    А вот тогда скажите лучше - что именно выпадает в осадок при добавлении Laemmli к пробе, содержащей GuaCl? Я так понял, что SDS, но в комплексе с чем? если с гуанидин-анионом, то нельзя ли таким макаром высадить весь гуанидин из пробы, или наш белок при этом тоже весь в осадок уйдёт? (но если брать избыток SDS, то может, и прокатит?...)



    comp3v /05.06.2006 18:55/
    да, и ещё, вдогонку - а когда в гель добавляют мочевину - нельзя ли таким образом "компенсировать" гуанидин в пробе (чтобы миграция шла нормально)?



    ммм /06.06.2006 15:45/
    ---Я так понял, что SDS, но в комплексе с чем? если с гуанидин-анионом, то нельзя ли таким макаром высадить весь гуанидин из пробы, или наш белок при этом тоже весь в осадок уйдёт?

    Если это так то можно, но тогда существует опасность, что и часть белка попадетв этот осадок.

    ---да, и ещё, вдогонку - а когда в гель добавляют мочевину - нельзя ли таким образом "компенсировать" гуанидин в пробе (чтобы миграция шла нормально)?

    Подумайте хорошенько и поймет, что нельзя.



    atv /16.07.2006 13:45/
    расскажите, пожалуйста, для чего при форезе часто берут вместо второго стекла белую пластину (как она, кстати, правильно называется? алюминий-оксидная?) чем это лучше?
    и можно ли этот материал где-нибудь самому достать или купить подешевле? а то покупать фармациевский комплект очень уж долго и дорого...



    Utcn /17.07.2006 12:14/
    Это керамика с высокой теплопроводностью - для лучшего охлаждения геля. ИМХО, на фиг не нужна...



    Alder /18.07.2006 20:03/
    "а вот такой вопрос возник. У меня есть лизаты в гуанидиновом буфере (6M GuaCl, для последующей очистки на Ni-резине), и в идеале хотелось бы аликвоту оттуда брать на вестерн. Брать "прямо так" - однозначно не получается (при миграции получается жуть, тем более что наносить приходится довольно много, поскольку белок сильно разбавлен). Но я вот тут почитал, что некоторые мочевину добавляют прямо при приготовлении геля, и подумал - а нельзя ли такое же и с гуанидином сделать? то бишь, добавить его в сам гель... или это совсем дурная идея?"

    если концентрации белка позволяют, то развести образец раз в 10 и можно гнать форез, полосы чуть-чуть будут размыты.
    Иначе - метанол-хлороформом высадить, минут 5-20 дополнительных в зависимости от кол-ва проб



    Tom1 /18.07.2006 22:03/
    Алдер имхо тупо и храбро тху - все.....



    Гость /16.08.2006 08:22/
    Такой вопрос: При кипячении образца в синем буфере образуется углеводная пробка. Как от нее избавится? Говорят, что надо добавить А-амилазу, тогда в какой концентрации, и можно ли ее чем либо заменить?



    Гость /26.09.2006 17:45/
    Ребята, помогите плиз
    столкнулась с проблемой: покупаю бисакриламид, мне предлагают диакриламид. есть ли качественная разница (в количестве сшивок и т.д.) между бисакриламидом и диакриламидом?



    guest: ммм /27.09.2006 19:05/
    диакриламид очень сомнительное название. Возможно это димер акриламида, так этот супчик вообще сшивок давать не будет. А то что бисакриламидный аналог без метиленового мостика по идее должен содержать в своем названии слово гидразид и по большому счету довольно экзотичное соединение по сравнению с бисом.



    Гость /17.10.2006 14:05/
    Уважаемые коллеги, нет ли у кого-нибудь опыта "негативного окрашивания" геля с помощью ацетата цинка. Попробовал по описанной методике (Matsui et al.), но применbл не деионизованную воду, а обычный дистиллят. Успеха не имел. Если есть некоторые "хитрости", плз, поподробнее.
    Николай Полянский



    Гость /14.12.2006 13:07/
    необходимо выделить белок из мышечной ткани рыбы, подвергшейся тепловой обработке, для дальнейшего проведения электрофореза на автоматической системе FastSistem, какой экстрагирующий раствор лучше применить



    Гость /14.12.2006 13:07/
    необходимо выделить белок из мышечной ткани рыбы, подвергшейся тепловой обработке, для дальнейшего проведения электрофореза на автоматической системе FastSistem, какой экстрагирующий раствор лучше применить



    Pavel2 /14.12.2006 18:43/
    (Fibrinolysis @ 12.12.2005 12:10)
    Ссылка на исходное сообщение  В классической работе Лэмли (Laemli,U.K., Nature,227, 680 (1970))
    1x TGB = 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0,1% SDS pH=8,3

    Помогите разобраться. Мне нужно приготовить 1 л TGB готового к применению (я так понимаю 1xTGB). Для этого я беру Tris-base 15.1g + Glycine 94g + 50 ml SDS (http://molbiol.ru/protocol/17_01.html#s1)
    А как приготовить 50 ml SDS он в сухом виде. В стоке (кстати что это такое?) SDS 10%, значит нужно на 1 литр взять 100 г SDS?
    Объясните пожалуйста поподробней, скажу сразу я не биохимик. confused.gif



    Tom1 /14.12.2006 18:50/
    СДС сухой сыпать в буфер себя не любить....
    Делаите 10% сток т.е. на 100мл воды 10г СДС
    Соответственно сначала растворяите трис и глицин примерно в 900мл воды потом добалвяите 10% сдс и доводите до литра водой....



    guest: ммм /14.12.2006 18:59/
    ---СДС сухой сыпать в буфер себя не любить....

    Хе-Хе в электродный я так не делаю не сыплю, а вот во второй раствор для плазмид частенько сыплю сухого. Бо его там в 10 раз больше надо.

    --делаите 10% сток т.е. на 100мл воды 10г СДС

    Истино так. И кстати я его из пипетки прямо в минусовую камеру, для экономии. В два раза меньше расход. smile.gif



    Pavel2 /15.12.2006 00:54/
    Спасибо за Ваши ответы.
    Хотел еще узнать, я использую midi-камеру для электрофореза, мне 500 ml TGB хватит в качестве рабочего объема? И еще, я все правильно делаю для приготовления 1L TGB?
    Tris-base 15.1g + Glycine 94g растворяю в 900 ml Н2О, добавляю 50 ml SDS (5g SDS+50ml Н2О) и довожу до 1L Н2О
    Глицина не слишком много, половина упаковки приходится высыпать?



    Guest /15.12.2006 10:48/
    я делаю трис-глициновый буфер 10х: 144г глицина, 10г SDS, 30г Tris и до 1л воды. а потом уже разводится до 1х.



    Pavel2 /15.12.2006 11:22/
    (Guest @ 15.12.2006 07:48)
    Ссылка на исходное сообщение  я делаю трис-глициновый буфер 10х: 144г глицина, 10г SDS, 30г Tris и до 1л воды. а потом уже разводится до 1х.

    До 1х это допустим 100 мл 10хSDS+1000 мл воды?



    guest: ммм /15.12.2006 14:35/
    И еще, я все правильно делаю для приготовления 1L TGB?
    Tris-base 15.1g + Glycine 94g растворяю в 900 ml Н2О!

    НЕТ НЕ ПРАВИЛЬНО!!!! триса - 3г, глицина-14.4, SDS-1г или 10мл 10% на 1Л готового раствора.

    ---делаю трис-глициновый буфер 10х: 144г глицина, 10г SDS, 30г Tris и до 1л воды.
    А вот это правильно!!!



    guest: ммм /15.12.2006 14:43/
    ---До 1х это допустим 100 мл 10хSDS+1000 мл воды?

    Что есть 10х SDS в этой фразе? Если вот это: "10% сток т.е. на 100мл воды 10г СДС", то "НЕ ДОПУСТИМ".



    Masha11 /16.12.2006 14:11/
    что-то я не пойму цели? вам что нужно сдс получить чтоль однократный или все- таки тяжелый буфер??? если однократный тяжелый буфер, то наливаете 100 мл 10х и доводите до 1 литра водой. усё)



    Pavel2 /19.12.2006 15:33/
    Я здесь ошибся "До 1х это допустим 100 мл 10хSDS+1000 мл воды?". Имел в виду 10хTGB.

    Я вот еще что не понимаю.
    В методике PAAG электрофорез белков дана таблица для приготовления TGB - Tris-base 15.1g, Glycine 94g SDS 50 мл (сток 10%) на 1L. Я так понимаю это 5xTGB?
    А вот это тоже правильно?
    ---делаю трис-глициновый буфер 10х: 144г глицина, 10г SDS, 30г Tris и до 1л воды.
    Получается расхождения по глицину, это не принципиально?



    guest: ммм /19.12.2006 16:00/
    -- трис-глициновый буфер 10х: 144г глицина, 10г SDS, 30г Tris и до 1л воды.

    Это правильно. Это исходная система так сказать из первоисточника.

    ---15.1g, Glycine 94g SDS 50 мл (сток 10%) на 1L. Я так понимаю это 5xTGB?

    Это какая-то модификация с перегрузом по глицину 94 вместо 72.

    Вообще говоря, количество глицина весьма принципиально. Но все очень критично, если глицина недоложить и менее критично, если переложить. Небольшой перегруз по глицину позволяет использовать один электродный буфер для нескольких форезов. В процессе фореза из катодного буфера уходит часть глицина и приходит трис, соответственно отношение трис/глицин увеличивается, что есть плёхо, как я уже писал выше, некий запас глицина в исходном буфере позволяет использовать его повторно.

    Короче, модификация для бедных и ленивых.



    Гость /21.12.2006 12:10/
    Люди добрые, отзовитесь у кого есть в лаборатории PhastSistema, для быстого электрофореза, бьюсь одна, не биохимик, освоила изоэлектрофокусирование, на очереди SDS-электрофорез и 2D-электрофорез, методик нет. Помогите



    Гость /27.12.2006 18:40/
    В раствор для нанесения белка (gel loading buffer
    ) зачем добавляют Dithiothreitol, он также как меркаптоэтанол востанавливает дисульфидные связи?



    Pavel2 /27.12.2006 19:01/
    ->В процессе фореза из катодного буфера уходит часть глицина и приходит трис, соответственно отношение трис/глицин увеличивается, что есть плёхо, как я уже писал выше, некий запас глицина в исходном буфере позволяет использовать его повторно.
    <-
    А если слить весь буфер после фореза и перемешать отношение трис/глицин не выровняется заново?



    Pavel2 /27.12.2006 19:06/
    Еще такой вопрос, буфер с белками перед нанесением на гель нужно кипятить чтобы белки денатурировались?



    Tom1 /27.12.2006 19:16/
    1. В принципе да если не боитесь что белки "убежавшие" в нижний буфер Вам помешают поетому обычно фитровал после смешивания....
    2. А это зависит от задачи.......



    Pavel2 /27.12.2006 19:42/
    Мне необходимо разогнать белки на форезе, а потом провести иммуноблот и выявить IgE-АТ к этим белкам. Поэтому я хочу узнать, нужно раствор с белками кипятить перед нанесением на гель?



    guest: ммм /27.12.2006 19:52/
    Поэтому я хочу узнать, нужно раствор с белками кипятить перед нанесением на гель?

    Если это SDS форез, то НУЖНО!!!



    Guest /28.12.2006 09:35/
    (Pavel2 @ 27.12.2006 18:06)
    Ссылка на исходное сообщение  Еще такой вопрос, буфер с белками перед нанесением на гель нужно кипятить чтобы белки денатурировались?


    ну если в буфере есть мочевина, то конечно не надо.



    guest: ммм /28.12.2006 11:51/
    ---А если слить весь буфер после фореза и перемешать отношение трис/глицин не выровняется заново?

    А вот хрена вам лысого!!!! Трис который выходит в верхний гель он не из нижнего буфера, а из геля и его количество в нижнем буфере, компенсируется не глицином из верхнего буфера, а хлоридом из геля. А потерянный глицин остается в геле, который вы извлекаете из камеры.

    ---Еще такой вопрос, буфер с белками перед нанесением на гель нужно кипятить чтобы белки денатурировались?

    Скажем так денатурация это средство, с помощью которого увеличивается и стабилизируется процент связанного с белком SDS. Но то что при кипячении белки денатурируют. Биофизический фахт.

    Если вас волнует проблема того, что при денатурации белок может потерять антигенную детерминанту. То это вопрос филозовский - может потерять, а может и не потерять. К тому же блотированный на мембрану белок частично ренатурирует. Востановится ли при этом АГ детерминанта тоже вопрос филозовский. Короче, в вашем случае, если антиген покрасился, то все хорошо, а если не покрасился это еще не значит, что его там не было. Нужн иммунохроматография или иммуноперципитация для полной у уверенности.



    Pavel2 /15.01.2007 13:24/
    Меркаптоэтанол можно заменить Dithiothreitol?
    Какая здесь разница?



    guest: ммм /15.01.2007 13:48/
    ---Меркаптоэтанол можно заменить Dithiothreitol?
    МОНА!!!
    ---Какая здесь разница?
    а) ДТТ можно класть в два раза меньше чем МЭ по молям.
    б) ДТТ раз в 10 или больше дороже чем МЭ
    в) ДТТ менее летучь, менее вонючь, менее токсичен, не требует вытяжки.



    Гость /13.02.2007 13:30/
    Коллеги, есть ли у кого-то опыт выделения чистого HA вируса гриппа форезом, при каких условиях,белки окрашивать или нет? Подскажите!



    Гость /05.03.2007 12:12/
    А вот скажите, нужно ли контролировать pH акриламидного стока?



    guest: ммм /05.03.2007 14:20/
    --А вот скажите, нужно ли контролировать pH акриламидного стока?

    По рН акриламидного стока можно приблизительно контролировать качество акриламида. Измерять лучше по бумажке. При гидролизе акриламида образуется акриловая кислота и аммиак, последний, как более летучий частично уходит из раствора. Поэтому гидролизовавшийся раствор обладает некоей дополнительной кислотностью но рН чистой воды обычно может доходить до 5.2-5.5 поэтому если вы использовали деионизированную воду о плохом акриламиде будет говорить рН ниже 5-4.5 на диститлляте ниже 5. Но честно говоря это очень приблизительный метод и выдает информацию, если уж акриламид полное дерьмо, хуже чем квалификации реагент.



    Гость /05.03.2007 14:26/
    А если сток получился в районе 7,5?



    Guest /05.03.2007 17:18/
    ---А если сток получился в районе 7,5?

    По бумажке или по рН метру?

    Просто 30% АА там уже воды мало и рН уже не совсем тот, что в чистой воде. Индикатор этому подвержен меньше чем рН-метр.

    А вообще подозрительно, типа АА, кто-то подтитровал или забуферил.
    Еще варианты: не очень чистая вода.
    А вообще, если форез симпатичный, то я бы не заморачивался.

    У идеального АА рН раствора должен совпадать с рН воды, в которой его растворили.



    Гость /05.03.2007 18:26/
    По pH метру. В том-то и дело, что форезы отвратные
    Если бы все тип-топ, не заморочился бы никто, естественно.



    guest: ммм /06.03.2007 14:54/
    1) Проверте калибровку рН-метра
    2) Проверте рН воды в которой растворяли сток АА
    3) Померьте рН стока АА по индикаторной бумажке.
    4) Не делайте ничего из 1-3, а вместо этого, добавте в сток АА деионизирующей смолы дауэкс.

    Причины паршивого фореза: полохой АА, плохой Трис, плохой Глицин.
    Плохой рН. Плохие пробы (мало кипяченые, мало SDS, много соли или не тот рН в пробах)



    Танаит /06.03.2007 15:29/
    То есть все что угодно :))
    Ладно, будем искать.
    Спасибо всем за подсказки



    Гость /07.03.2007 07:22/
    у меня протеан 2 большой, помогите пожалуйста приготовить растворы белков для фореза, точнее как смешать образцы белков c sample буфером, сколько мкг белка надо взять и на сколько мкл, такая проблема: я наношу белки, а разделения нет после фореза, и сколько Вольт и амперы нужны при форезе, я новичок - обьясните простым языком... заранее спасибо, жду ответа срочно



    Nastasya /28.03.2007 11:59/
    А если концентрирующий гель полимеризуется где угодно: в стакане, розлей на стол на столе... но никак не между стеклами, если уж соизволит то это больше похоже на приступ насморка у слона, что может быть не так?



    accelerant /31.03.2007 12:52/
    (Гость @ 07.03.2007 14:22)
    Ссылка на исходное сообщение  у меня протеан 2 большой, помогите пожалуйста приготовить растворы белков для фореза, точнее как смешать образцы белков c sample буфером, сколько мкг белка надо взять и на сколько мкл, такая проблема: я наношу белки, а разделения нет после фореза, и сколько Вольт и амперы нужны при форезе, я новичок - обьясните простым языком... заранее спасибо, жду ответа срочно


    Иногда все же полезно научиться излагать свои мысли связно..



    Гость /06.04.2007 14:05/
    Подскажите молекулярную массу ферритина свиньи,или методику его выделения из селезенки если такое возможно



    Сергей Васильевич /06.04.2007 14:14/
    Подскажите молекулярную массу ферритина свиньи, или методику его выделения из селезенки если такое возможно



    guest: ммм /06.04.2007 15:36/
    Подскажите молекулярную массу ферритина свиньи

    Точно не помню жираф большой, около 500-600кДа это нативный в конце концов можно в Генбанке уточнить.

    или методику его выделения из селезенки если такое возможно.

    Такое возможно, а методики нужно искать в первоисточниках.



    bukach /06.04.2007 18:49/
    (Сергей Васильевич @ 06.04.2007 14:14)
    Ссылка на исходное сообщение  Подскажите молекулярную массу ферритина свиньи, или методику его выделения из селезенки если такое возможно



    а) базы данных, например swiss prot ( http://us.expasy.org/sprot/ )
    вот что он про ферритин пишет. если пойдете по ссылкам, то там помимо его а.к. последовательности обнаружите еще и ссылки на статьи по выделению
    http://ca.expasy.org/cgi-bin/sprot-search-...rritin%2C%20pig ( http://ca.expasy.org/cgi-bin/sprot-search-de?ferritin%2C%20pig )

    б) еще PubMed не бесполезен в подобных разысканиях



    Гость /18.05.2007 15:44/
    Помогите!
    Уже испробовали все, что могли!
    После прокраски таинственно исчезают все белки до 70 кДа. Причем в концентрирующем геле их нет ?!



    Dmitry Molotkov /25.06.2007 13:14/
    Подскажите, если кто знает, как самому сделать градиент-формер для приготовления градиентных ПААГ. Буду рад любым ссылкам, описаниям, принципам работы и т.д. Заранее спасибо.



    guest: ммм /26.06.2007 18:19/
    --Помогите!
    Уже испробовали все, что могли!
    После прокраски таинственно исчезают все белки до 70 кДа. Причем в концентрирующем геле их нет ?!

    опишите протокол окраски.
    С составами растворов.

    Похоже они у вас вымываются либо фиксация, либо окраска хромают.



    guest: ммм /26.06.2007 20:22/
    --Подскажите, если кто знает, как самому сделать градиент-формер для приготовления градиентных ПААГ. Буду рад любым ссылкам, описаниям, принципам работы и т.д. Заранее спасибо.

    Принцип описан у Остермана в электроферозном томе.

    Самый топорный вариант два стакана и две U-образные трубки с длиной рук не меньше чем высота стакана(трубки должны иметь кран или любое устройство отсекающее поток в них. Два стакана соединяются одной трубкой(как сообщающиеся сосуды) из одного из стаканов второй трубкой делается слив. В стакан со сливом помещается магнитный мешальник, конструкция водружается на магнитную мешалку. Сливную трубку соединяют с резервуаром в котором собираются сотворить концентрационный градиент. Готово дело.



    Сделать можно из двух бакпечаток. Или баночек на их основе.
    http://www.medp.spb.ru/product/lp_bpk.php ( http://www.medp.spb.ru/product/lp_bpk.php )

    В одной баночке у самого дна в цилиндрической стенке делается отверстие по диаметру чуть больше чем стержень от шариковой ручки, в другой делаются два таких отверстия одно напротив другого(как бы лежащие на противоположных концах диаметра). В каждое отверстие вставляется по отрезку от трубочки стержня шариковой ручки для того что бы стержень герметично зафиксировался в отверстии на отрезок трубочки одевают уплотнительное резиновое колечко(например из нипельной велорезины или тонкой силиконовой трубки). У вас должно получится две емкости со сливными трубочками снизу - у одной - одна, у другой - две. Теперь с помощью тонкой резиновой трубочки(силикон) надо соединить одну емкость с другой. Трубочка должна быть такой длины, что бы ее можно было легко пережимать каким-нибудь зажимом. У вас должно получится два сообщающихся сосуда, пермычку между которыми вы можете перекрывать зажимом. У одного из сосудов должна остаться еще одна сливная трубочка. К этой трубочке надо так же подсоединить тонкую резину, в конец которой вставлен тонкий типик от автоматической пипетки или игла от шприца. Эта сливная трубочка тоже должна иметь возможность перекрываться зажимом. Все! Теперь осталось сделать магнитный мешальник из обрезка гвоздя запаянного в туже трубочку от стержня шариковой ручки. Хэнд мэйд градиент готов. Вместо баночек можно использовать шприцы или пробирки с плоским дном.

    Другой продвинутый вариант делается из двух толстых блоков орг стекла.

    Толщина 30-40мм и где то 85х85(150х150) мм размером

    В одном рядом друг с другом паралельно в торце делаются два сквозных отверстия подходящего диаметра(15-20мм)(прообраз все тех же сообщающихся сосудов) высота(глубина) подбирается в зависимости от объема градиента, но выше 150мм не надо. В торце другой заготовки примерно по центру делается глухое толстое отверстие диаметров от 8-12мм и глубиной мм 50-75 - это основа будущего цилиндрического крана. Расстояние от глухого конца отверстия до ближайшего торца блока должно быть мм на 5 больше чем диаметр сообщающихся сосудов. Теперь в заготовке с глухим отверстием надо сделать два масеньких отверстия лежащих на одной линии и перпендикулярно плоскости заготовки в глухое отверстие( так сказать перпендикулярно оси глухого отверстия и вдоль оси этого глухого отверстия (те как бы отверстия в стенке глухого отверстия). Второе требование к этим отверстиям расстояние между ними должно быть таким, чтоб если к ним приложить заготовку с сообщающимися сосудами(осями сосудов перпендиколярно плоскости второй заготовки, образуя подобие тавра), то оба маленьких отверстия попадают каждое в свой сосуд при этом один из сообщаюшихся сосудов краем своего дна должен обязательно попадать за пределы глухой стенки глухого отверстия. Теперь в заготовке с глухим отверстием делается третье масенькое отверстие не сквозное, а глухое, на той же линии, что и первых два, но уже за глухой стенкой, оно должно быть на таком расстоянии от ближайшего, что бы они оба оказались в пределах дна одного из "собщающихся" сосудов в другой заготовке. При прикладывании заготовки с сообщающимися сосудами к заготовке с глухим отверстием, два маленьких отверстия, попадающих в стенку глухого отверстия должны попадать в дно двух разных "сообщающихся" сосудов, а маленькое глухое отверстие должно быть в пределах дна оного из "сообщающихся" сосудов. Теперь если маленькие отверстия поставить вертикально, то в горизонтальном направлении надо от ближайщего торца заготовки просверлить отверстие соединяющее дно маленького глухого отверстия с торцом заготовки - это аналог сливного канала(Г-образный канал). Теперь осталось изготовить кран, который представляется из себя стержень из оргстекла или тефлона ответный глухому отверстию те соответствующий ему по диаметру(на пару тройку соток меньше) и чуть длинней, чтоб было за что крутить, стержень нужно снабдить воротком или рычажком, с помощью которого его можно вращать в отверстии. В боковой поверхности стержня выфрезеровывается продольная проточка по ширине равная диаметру масеньких отверстий в стенке глухого отверстия, а длинной точно совпадающая с расстоянием между наиболее удаленными краями этих отверстей(глубина особого значения не имеет). Эта проточка таким образом образует канал соединяющий эти два масеньких отверстия, когда стержень(кран) вставлен в глухое отверстие(получаются сообщающиеся сосуды), если кран повернуть, то эти отверстия разъединятся(сосуды разобщаются). Ну теперь приклеиваем первую заготовку с сообщающимися сосудами ко второй, так чтоб в одном сосуде было одно отверстие, а в другом два одно с краном, а другое сливное, присоединяем к сливному шланг с зажимом и наконечником. Все.

    Если вы чего-нибудь поняли, то с вас пиво, если не поняли, то пиво в двойне. Честно, нельзя такие вопросы в форуме задавать это надо рисовать и показывать. Отдельного труда стоит. Это просто у меня сегодня отходняк от защиты дипломов вот я и растекся словом по монитору



    Ъ /26.06.2007 22:44/
    Да, МММ, очень хорош отходняк. Вы не ленивы. Уважаю, уважаю beer.gif beer.gif



    Dmitry Molotkov /27.06.2007 09:36/
    Спасибо, МММ, с меня действительно пиво, не ожидал такоко подробного описания.



    Гость /10.11.2007 00:34/
    Кто нибудь сталкивался с ситуацией, когда синие образцы после начала фореза подтекают между стеклом и stacking гелем? Какие могут быт причины и решения? Спасибо!



    Guest /10.11.2007 01:28/
    от синих образцов полоскание в марганцовке помогает. или Ёд.



    Гость /10.11.2007 03:08/
    Полоскание чего?



    guest: ммм /10.11.2007 16:58/
    --Кто нибудь сталкивался с ситуацией, когда синие образцы после начала фореза подтекают между стеклом и stacking гелем? Какие могут быт причины и решения? Спасибо!

    Причина отход геля от стекла.

    Это у вас либо плохой набор(прокладок) разброс по толщине гребенки и боковых прокладок, либо грязное стекло. Либо когда вынимаете гребенку очень сильно механически воздействуете на стекла блока.



    Guest /10.11.2007 20:31/
    Пользуясь приемом, подробно описанным ммм, можно заливать сразу несколько идентичных гелей, если изготовить из оргстекла "скворечник", стоящий острием- призмой вниз - в основную часть ставятся собранные стекла со спейсерами , обмотанные скотчем так, чтобы его концы свисали снаружи, а в острие ( там внутри слепая трубочка с двумя симметричными ответстиями по бокам, так, что струя "бьет" в стенку призмы, а не наверх) закачивается сначала пропанол, затем градиент, начиная с легкого 5% раствора акриламида и кончая тяжелым раствором, к которому добавляют для стабилизации еще и 10% сахарозу (объем компонентов определить заранее). Затем начать закачивать 50% сахарозу, в самую первую фракцию которой капнуть бромфенол- и затем долить остальную). Когда бромфенол окажется на уровне нижнего конца стекол ( финиша гелей), закачивание прекратить, и все сооружение перенести в теплую воду, градусов 50. Количество ТЕМЕДа и сульфата аммония должно быть снижено раза в три-четыре ( подберите эеспериментально - в зависимости от концентрации гелей, чтобы не полимеризовался при комнатной температуре в течение минут 40 - часа), растворы должны быть при закачке охлажденными, а полимеризация начинаться после перенесения в теплую воду. Растворы акриламида-бисакриламида готовятся в нужном буфере, но БЕЗ SDS - он все равно идет впереди при форезе . Наутро извлечь "кассету" готовых гелей за хвосты оставленного снаружи скотча. Метод хорошо работал для небольших гелей -10x10, например. Кроме идентичности гелей и создания запаса (хранить в буфере, дозаливать только "гребенку" по мере необходимости) плюс еще и в том, что устаняется возможность "протечек" при заливке градиента . Форму градиента можно задавать любую, в зависимости от формы сосудов ( цилиндрическая, коническая с расширением вверх или вниз - это есть в старых учебниках по ионообменной хроматографии), в том числе близкую к экспоненте.

    Насчет отслоения геля - если это происходит из-за излишних "усилий", то легче вынимать гребенку, закапав вдоль гребенки воды или буфера - так, чтобы в пустые лунки входила жидкость, а не воздух.



    guest: Vasyl /15.11.2007 07:07/
    (guest: ммм @ 10.11.2007 16:58)
    Это у вас либо плохой набор(прокладок) разброс по толщине гребенки и боковых прокладок, либо грязное стекло. Либо когда вынимаете гребенку очень сильно механически воздействуете на стекла блока.


    Не, стекла мытые -> сполоснутые дистиллятом ->70% этанолом. А насчет системы - чем богаты тем и рады, MiniProteanII from Bio-Rad. Может, попробовать что-нибудь в гель добавить, чтоб он лучше к стеклу прилипал? Известны ли современной науке такие весчества? Кроме клея для стекла?



    guest: ммм /15.11.2007 13:26/
    --Не, стекла мытые -> сполоснутые дистиллятом ->70% этанолом.
    И грязные. smile.gif

    -- А насчет системы - чем богаты тем и рады, MiniProteanII from Bio-Rad.

    Ну раз богаты, то радуйтесь. Закажите новые стекла и будет вам счастие. Или лучше напишите рекламацию: "Мол гавно у вас система, стекла, типа, в горячей хромке не помыть, потому что тут вашим прокладкам и кирдык наступит.

    У вас, например могли, попортится прокладки, а они часть стекла, так что от смены стекла никуда не деться.
    --Известны ли современной науке такие весчества? Кроме клея для стекла?
    Ага! Алилтриэтоксисилан - обрабатывать надо стекло, но после этого гель к стеклу приторчит КОВАЛЕНТНО. smile.gif



    polly /15.11.2007 19:39/
    Ребята, разъясните мне безграммотной, как приготовть трис-Сl ph 8,8 и 6,8 которые используют в белковом форезе? В прописях на сайте найти не могу frown.gif



    comp3v /15.11.2007 19:42/
    (polly @ 15.11.2007 18:39)
    Ссылка на исходное сообщение  Ребята, разъясните мне безграммотной, как приготовть трис-Сl ph 8,8 и 6,8 которые используют в белковом форезе? В прописях на сайте найти не могу frown.gif
    а в чём непонятность-то? готовится обычный трис (1M или 1,5M), перед "доливанием" до конечного объёма доводится pH до нужного значения - и всё, собсно



    polly /15.11.2007 19:52/
    (comp3v @ 15.11.2007 17:42)
    Ссылка на исходное сообщение  а в чём непонятность-то? готовится обычный трис (1M или 1,5M), перед "доливанием" до конечного объёма доводится pH до нужного значения - и всё, собсно


    Что то это мне картину никак не происнило , Скажите сколько чего сыпать confused.gif



    comp3v /15.11.2007 20:01/
    мнэээ... во студенты пошли...
    сколько сыпать - зависит от того, что у Вас есть. Посмотрите на банке с трисом (я не знаю, что там у вас - Trzima base или ещё чего), какая у него молекулярная масса. Определитесь, какой объём хотите. Ну и сыпьте, соответственно, m[г]=Mw[г/моль]*V[л]*с[моль/л]



    polly /15.11.2007 20:04/
    а НСl сколько надо добавлять



    comp3v /15.11.2007 20:06/
    ставите на мешалку, суёте pH-метр, и капаете себе потихоньку, покуда не доведётся до нужного значения



    guest: ммм /15.11.2007 20:06/
    Откройте книжечку методичку про буферные растворы и почитайте, а так долго объяснять.

    Если кратко то взвешивате основание трис чтоб получалось по молярности на нужный объем. Растворяете в обьеме меньшем раза в 2, полтора, потом подтитровываете концентрированной солянкой на рН-метре и доводите водой до нужного объема. Ну, есть тонкости, имено, с трисом, его лучше до обема не доводить а дать денек постоять, потом еще раз подтитровать, а потом только подводить объем.



    polly /15.11.2007 20:19/
    К сожалению методички нет, а то бы почитала и не мучила бы никого.
    Спасибо Вам огромное, уважаемый "guest: ммм " Все стало понятно, только я вот не знаю какой моляльности должен быть трис, В описании белкого фореза в приготовлении растворов фигурирует просто tris-Cl pH 8,8 и 6,8



    Tom1 /15.11.2007 20:41/
    Найдите Остермана и будет Вам счастье....
    или посмотрите раздел "методы" на данном сайте там тоже прописи есть.....
    http://molbiol.ru/protocol/ ( http://molbiol.ru/protocol/ )



    Ъ /15.11.2007 20:55/
    Нужного рН 1М Трис НС1 готовится сливанием 1М-х растворов Трис НС1 и Трис ОН. Еще проще - ссыпанием нужных навесок обоих Трисов и доведением до метки. Если будете работать аккуратно (точные навески и температура окр.среды), ошибка не более 0,05.



    guest: ммм /16.11.2007 13:54/
    Нужного рН 1М Трис НС1 готовится сливанием 1М-х растворов Трис НС1 и Трис ОН. Еще проще - ссыпанием нужных навесок обоих Трисов и доведением до метки. Если будете работать аккуратно (точные навески и температура окр.среды), ошибка не более 0,05.

    Ну для этого нужна табличка. И два реактива вместо одного (ибо HCl стоит дешевле дистиллята). Да и с навесками там не тривиальный расчет нужен будет чтоб молярность по трису сохранить. Но если нет рН-метра, то только так и делать иначе никак.



    Ъ /16.11.2007 18:38/
    В готовом трисе, полученном этими двумя методами, содержание вещества одинаково. Но затраты времени несравнимы, а также не контактируешь с конц. НС1 (ну пусть будет 1:1), рН контроль по бумажке (приятно!). Много преимуществ! А где эту табличку найти? - на сайте Sigma (лень искать smile.gif,пардон). А кому нужны сотые доли рН ?, ну тогда можно и рН-метр завести. smile.gif Себестоимость ниже. если с учетом затрат времени и полученных эмоций. smile.gif tongue.gif



    Guest /16.11.2007 20:38/
    (guest: Vasyl @ 15.11.2007 07:07)
    Может, попробовать что-нибудь в гель добавить, чтоб он лучше к стеклу прилипал? Известны ли современной науке такие весчества? Кроме клея для стекла?
    - если в концентрирующий гель добавить diallyltartardiamide вместо бисакриламида, то гель получается очень "пластичный" и образцы не перетекают. Правда, из-за пластичности (если начистоту, то "сопливости" smile.gif ) геля гребенку лучше извлекать, добавляя вдоль гребенки чтобы вместо воздуха входил, буфер - или даже просто под струей воды, иначе ячейки получатся кривые, и столбики придется выравнивать иглой



    guest: ммм /16.11.2007 21:38/
    --В готовом трисе, полученном этими двумя методами, содержание вещества одинаково.

    Нет, только если смешивать растворы. Если по сухому весу делать надо либо пресчитывать объемы на 100мл по сумме и высчитавать потом навески, либо высчитывать объем по табличке как сумму объемов растворов и тогда его нужно доводить в мерном цилиндре, что не всегда удобно.

    -- на сайте Sigma
    Сайт может быть просто недоступен из-за отсутствия связи. Так что табличку придется не только найти, но и распечатать, заранее подготовившись, и взять с собой.

    --Но затраты времени несравнимы, а также не контактируешь с конц. НС1

    если взвешивать сравнимы.

    Если бороться с солянкой, то тогда от акриламида, надо просто в обморок падать.

    --Себестоимость ниже. если с учетом затрат времени
    Затраты времени стоят очень по разному в США, России и Китае, например.
    --и полученных эмоций.

    Это вообще вещь субьективная

    Кроме того солянокислый трис, вроде дороже основания и при том еще в нем содержание основного вещества меньше. Ты платишь за лишний вес моля солянки, к каждому молю триса.

    Если ты заранее приготовишь растворы тебе никогда не сделать трис концентрированей твоих исходников. А например 3М трис рН 8,8 вообще таким способом(слиянием растворов не сделать, 3МТрис основание просто не растворяется в воде), а подтитровкой он делается.



    Гость /19.11.2007 12:22/
    может кто подскажет как



    polly /30.11.2007 16:18/
    Народ, помогите. Купили в лабмаге камеру для вертикального фореза белков на 2 геля (VE-20) Если ее просто так собрать , то она понятное дело течет, Нужно ее пролить по периметру, для это мы так поняли там и канавка есть, + в коробку вложены 2 пробирки с белым порошком и 2 типа пипетки. Похоже это для проливки, но абслютно не написано, что это, в чем разводить и в каком количестве. Если кто знает что с этим делать, ПОЖАЛУЙСТА, подскажите.



    guest: ммм /30.11.2007 17:24/
    Это камера хеликоновская, если мне не изменяет память, сходите на их сайт, если там недостаточно материала. Звоните прямо им, они вам все должны рассказать, тем более они очень гордятся, что выпускают эти изделия.



    polly /30.11.2007 19:32/
    точно, хеликоновская.Спасибо за идею, но на сайте у них ничего про проливку и слова не написано. Зато про то как готовить гели, просто учитайся. :)



    Guest /30.11.2007 20:50/
    готовите агарозу 2%
    плавите
    собираете камеру (стекла-спейсеры-зажимы)
    расплавленную агарозу наливаете на канавки
    пока она не застыла, ставите собранные стекла нижней частью прямо в нее
    ждете, пока застынет, не трогаете, заливаете гели



    Guest /30.11.2007 20:50/
    готовите агарозу 2%
    плавите
    собираете камеру (стекла-спейсеры-зажимы)
    расплавленную агарозу наливаете на канавки
    пока она не застыла, ставите собранные стекла нижней частью прямо в нее
    ждете, пока застынет, не трогаете, заливаете гели



    polly /30.11.2007 21:34/
    спасибо, но имела в виду не то как делать агарозную пробку, а как сделать так, чтобы камера не текла :)



    ужик /01.12.2007 18:09/
    Кто-нибудь занимается 2-D электрофорезом (первое направление по заряду, второе - по Лэммли). у меня молекулярные массы сильно отличаются от одномерного.



    guest: Гость /06.12.2007 16:35/
    Кто может за вознограждение провести форез



    guest: ммм /06.12.2007 17:59/
    --Кто может за вознограждение провести форез

    Я!



    Ъ /06.12.2007 18:19/
    (guest: Гость @ 06.12.2007 15:35)
    Ссылка на исходное сообщение  Кто может за вознограждение провести форез

    И я тоже lol.gif lol.gif lol.gif Вознаграждение какое будет? confused.gif



    guest: ммм /06.12.2007 21:36/
    Ять! Зачем тебе целый воз гражданских ног?
    И вообще в очередь. Вас здесь нестояло.



    Tom1 /06.12.2007 21:45/
    Почем опиум для народа?????
    "Восприемник" сходил бы лутше в топик что кислород может как быший химик что-то умное сказал бы....



    bukach /06.12.2007 23:47/
    (guest: Гость @ 06.12.2007 16:35)
    Ссылка на исходное сообщение  Кто может за вознограждение провести форез


    а Вам какой? по Лэммли, трициновый, по Шванку и Мункресу, по Дэвису, по Шагеру (blue и colorless), по Веберу и Осборну, нативный в гомогенной системе (несколько разных), изоэлектрофокусирование в нативных или денатурирующих условиях? или ещё какой? возможно в градиентных гелях, по желанию в присутствии мочевины.



    guest: ммм /07.12.2007 11:16/
    --Восприемник" сходил бы лутше в топик что кислород может как быший химик что-то умное сказал бы....

    Ты! Думаешь я его не читал. пока ничего красивого в голову не лезет, вот и молчу в тряпку.



    Ёлкин /10.02.2008 22:17/
    Люди знающие! Сегодня дал студентам сделать PAGE по прописи с этой странички, вроде как они все сделали правильно, но вот форез идет безобразно: бромфеноловый синий расплывается по вертикали, и чуть ниже него идет тонкая красно-оранжевая полоса.

    Вопрос: за что именно проугать студентов, если завтра утром я буду переделывать этот форез вместо того чтобы счастливо ставить блот? confused.gif

    PS: Сам по этой прописи регулярно ставлю форезы, все прекрасно получается.



    Картинки:
    Прикреплённое изображение

    bukach /10.02.2008 22:46/
    имхо, просто перебухали бромфенолового. сие не есть смертельно.
    покрасьте гель для полной уверенности в том, что всё ок.

    з.ы. и вот нечего детей заставлять по воскресеньям работать wink.gif



    Guest /10.02.2008 22:55/
    Это SDS-PAGE, судя по тонкой нижней полосе? - так идут мицеллы SDS и все, что туда налипло. Бромфенол не сконцентрировался, очевидно - или много соли в образце, или "не получилось" pH-скачка, или там, где должен быть только глицин,по ошибке появился и хлор ( кстати, может, старый верхний буфер использовали, смешав с нижним от предыдущего фореза ?).



    HACTEHKA /26.02.2008 19:15/
    Подскажите, пожалуйста.

    При проведении электрофореза идет все как нужно, но при окраске Кумасси выясняется, что снизу есть большая темная синяя полоса примерно 1,5 см, и по всей видимости, белки идут только до ее начала.

    При вестерне на границе с началом этой полосы определяются белки по всей ее длине на одном уровне вне зависимости от их молекулярной массы.
    С чем это может быть связано?



    comp3v /26.02.2008 19:28/
    это называется фронт миграции



    HACTEHKA /26.02.2008 19:47/
    (comp3v @ 26.02.2008 19:28)
    Ссылка на исходное сообщение  это называется фронт миграции

    И как его избежать? При этом при прохождение электрофореза, если следить за краской, то все в порядке, а на самаом деле белки не дошли.



    comp3v /26.02.2008 19:55/
    да никак не избежать, просто гнать дольше. В норме фронт миграции - идёт вместе с бромфеноловым (то есть то что вы видите как полосу краски), но часто оказывается что реальный фронт белков чуть выше (у меня это обычно бывает с маленькими биорадовскими гелями). Не знаю, как это объясняется, я просто гоню так чтобы краска полностью вышла, и всё. А если интересующий белок маленький и идёт в этой самой области, то надо процентность геля побольше брать.
    Это всё если, конечно, мы об одном явлении говорим.



    HACTEHKA /26.02.2008 23:49/
    Да-да, именно маленькие биорадовские гели))



    Бору /28.02.2008 22:02/
    Вертикальная камера, розделяющий гель залит, но не очень плотно пристает к боковым стенкам (те которые не стеклянные), после заливки концентрирующего тот уходит в образованные щели, и доходит до самого низу. Это не страшно?



    Tom1 /28.02.2008 22:56/
    рАзделяющий...
    Не смертельно....



    Guest /29.02.2008 01:20/
    (Бору @ 28.02.2008 21:02)
    Ссылка на исходное сообщение  Вертикальная камера, розделяющий гель залит, но не очень плотно пристает к боковым стенкам (те которые не стеклянные), после заливки концентрирующего тот уходит в образованные щели, и доходит до самого низу. Это не страшно?


    А как это выглядит в концентрирующем геле? У Вас при этом крайние лунки целые получаются, или вытекают?



    Бору /29.02.2008 08:23/
    Гель вытекал по краям немного, периодически доливали, пока не застыл. Все это случилось я думаю по двум причинам: 1) слишком рано начали заливать конц. гель, а разделяющий еще не засыл полностью 2) когда удаляли слой воды над розд. гелем вылили его полностью (в том числе и незастывший розд гель из всех щелей) а надо было просто промокнуть бумагой сверху и все.



    Guest /29.02.2008 10:34/
    Попробуйте, когда вставите гребенку, залепить по краям пластилином (чтобы пространство между крайней лункой и спейсерами было закрыто небольшими кусочками пластилина). Делать это надо сразу, как вставите гребенку. Мне помогает.



    Ёлкин /25.03.2008 21:46/
    Маленькое дополнение: титровать TGB не надо.



    Beonick /02.04.2008 12:43/
    Как готовить пробы для SDS фореза из ткани? По одной прописи к гомогенату нужно кроме ингибитора протеаз прибавлять SDS, что потом мешает при определении белка. Кроме того SDS есть в Loading buffer, подскажите плз нужен он вообще при приготовлении проб где то, кроме как в Loading buffer, и как добиться нужного уровня разрушения клеток и екстракции белков, если исключить его?



    guest: ммм /02.04.2008 13:50/
    --нужен он вообще при приготовлении проб где то, кроме как в Loading buffer,

    Не нужен "кроме, как в Loading buffer"

    --и как добиться нужного уровня разрушения клеток и екстракции белков, если исключить его?

    Дезинтеграция, дезинтеграция и еще раз дезинтеграция, Батенька. Любыми доступными спосбами, это архиважно для текущего момента. smile.gif

    Ну, и не забывайте о неионных детергентах и 8М мочевине, но последнюю все же лучше перед нанесением подразбавить раза в два.



    Бору /03.04.2008 21:39/
    При проведении электрофореза под лунками в конц геле выпали белые полосы осадка; после окрашивания проявился только размытый тяж от начала разд. геля.
    user posted image

    Полагаю причина в использованиии не оч. свежего ДСН. (В растворе буфера для образцов где конц. ДСН 2% находится в виде осадка при комнатной температуре). Как его перекристализируют?



    guest: ммм /04.04.2008 11:54/
    Полагаю что вы забыли ДСН в электродный буфер добавить..

    Перекристализовывают из горячего спирта.



    Бору /04.04.2008 12:10/
    300г на 7 л спирта, спасибо я уже нашел.
    Нет, в электродный буфер и гель вносили 0,1% ДСН. Если мне не изменяет память smile.gif



    Гость /09.04.2008 18:51/
    МММ, подскажите, пожалуйста, почему при форезе по Лэмли может закисляться нижняя часть геля? Гоню минигель, на последних миллиметрах часть фронта BpB желтеет; после окраски кумасси видно, что в том месте, где гель закислился, белки останавливаются.
    Акриламид свежий, pH всех растворов в норме. Сомнения вызывает только буфер для нанесения - рН 6,9



    guest: ммм /09.04.2008 20:21/
    --на последних миллиметрах часть фронта BpB желтеет; после окраски кумасси видно, что в том месте, где гель закислился, белки останавливаются.

    ЭЭЭ, часть фронта? Поперек поля или вдоль?

    Вообще-то после вхождения в разделяющий фронт разделяется на 2 границы впереди бежит хлор, сзади глицин, мелкие белки бегут с глицином БФС бежит между ближе к глицину(если не изменяет память). Бывает ,что БФС грязный и у него появляется желто-коричневая полоса(примеси) во фронте глицина.



    Гость /09.04.2008 20:37/
    ---ЭЭЭ, часть фронта? Поперек поля или вдоль?

    Часть фронта. Поперек поля.
    Другими словами, желтеет не часть БФС по всей ширине форнта, а весь БФС в какой-то части фронта.



    Dimych /10.04.2008 04:15/
    (Бору @ 03.04.2008 18:39)
    Ссылка на исходное сообщение 
    Полагаю причина в использованиии не оч. свежего ДСН. (В растворе буфера для образцов где конц. ДСН 2%  находится в виде осадка при комнатной температуре). Как его перекристализируют?

    Эээээ.... Не очень свежий это как? Годами стоит на полке в растворе и ничего ему не делается. В сухом виде десятилетиями. Довольно стабильная фиговина. Не майтесь дурью с перекристаллизацией. Осадок в 2% растворе при КТ наводит на мысли о наличии в растворе калия. Когда муть видна? При смешивании с образцом? Или "на клетке с буйволом надпись слон". В том смысле, что у Вас вместо ДСНа непонятная смесь.



    Бору /10.04.2008 19:20/
    Да счет идет именно на десятилетия smile.gif
    Для того чтобы сделать 2%-ный раствор надо нагревать, при комнатной температуре выпадает осадок. Калия нигде не даем.
    После кипячения с пробами (и остывания) мути будто бы не видно. В лунках тоже ничег оне остается, вся проблемма в том, что он выпадает после вхождения в гель. Акриламиду третий год, может причина в его "чистоте"? А может сделать деионизацию мочевины перед добавлением в гель?



    guest: ммм /10.04.2008 20:18/
    ---Часть фронта. Поперек поля.

    Никогда не сталкивался с таким. Там неоткуда браться кислоте, разве что закисление анодного пространства, если анод расположен близко к гелю, а электродный буфер не новый и плохо перемешивается, но это так маловероятно.



    fagot-bsu /18.04.2008 17:02/
    У меня несколько вопросов:
    1) и самое важное: кто-нить когда-нить сушил гели ПААГ, есси да отпишитесь как мона подробнее как енто делать
    2) очень важно. Если кто-то работал в программах серии Amersham (tatal lab, Image quant) ОООООООгромная просьба откликнуться и ответить какой метод выбора background substaraction юзаете вы и почему (не могу выбрать rollingball или Image rectangle)
    3) мой научник посоветовал мне увеличить молярность буферов на 30%, оно и пнятно напряженность при переходе концентрирующий гель - рабочий гель padaet eshe silnee, но в результате получилось, что часть белковые полосы начали демонстрировать самые разные отклонения. Однако я не уверен, что причина таких выкрутасов именно в етом,есси когда-тоделали что-то подобное отпишитесь
    4) возможно ли построить калибровку, степень окрашенности от молекулярной массы ispolzuya Kumassi g250 ili Dameral serebro

    PS sry za translit (debilniy komp v labe)



    guest: ммм /18.04.2008 21:05/
    --1) и самое важное: кто-нить когда-нить сушил гели ПААГ, есси да отпишитесь как мона подробнее как енто делать

    http://molbiol.ru/protocol/17_06.html ( http://molbiol.ru/protocol/17_06.html )
    http://molbiol.ru/protocol/17_13.html ( http://molbiol.ru/protocol/17_13.html )
    http://molbiol.ru/protocol/17_12.html ( http://molbiol.ru/protocol/17_12.html )

    Ключевым является использование целлофана(регенерированной целлюлозы) и вымачивание геля в растворе для сушки.(кстати я пользуюсь другими растворами, но и этот должен работать)

    --2) очень важно. Если кто-то работал в программах серии Amersham (tatal lab, Image quant) ОООООООгромная просьба откликнуться и ответить какой метод выбора background substaraction юзаете вы и почему (не могу выбрать rollingball или Image rectangle)

    Забейте, попробуйте крякнутый софт типа Bioplot, Totallab или open soft типа ImageJ, где взять крякнутый спросите в разделе форума биософта.

    --3) мой научник посоветовал мне увеличить молярность буферов на 30%, оно и пнятно напряженность при переходе концентрирующий гель - рабочий гель padaet eshe silnee, но в результате получилось, что часть белковые полосы начали демонстрировать самые разные отклонения. Однако я не уверен, что причина таких выкрутасов именно в етом,есси когда-тоделали что-то подобное отпишитесь.

    Не делал не советую, Лэмли и так в 2 раза увеличил концентрации по сравнению с исходной системой, ничего кроме дополнительного разогрева или удлинения времени фореза это не даста результат диффузия. Это оправданно при высоких нагрузках по белку и высокой соле в пробе. И концентрирование происходит вовсе не при переходе в разделяющий, а на границе глицин хлор уже в концентрирующем. Если у вас не очень острые зоны, а буфера проверены и перепроверены из лучших реактивовов, то виноват акриламид. Деионизуйте его над смешанным ионообменником и будет вам счастие.

    --4) возможно ли построить калибровку, степень окрашенности от молекулярной массы ispolzuya Kumassi g250 ili Dameral serebro

    Несовсем понял. Вы думаете, что интенсивность окраски зависит от размера белка.

    Нет! Кумаси красит на массу белка(с вариациями, см топик про Брэдфорд). Строго говоря, он красит лизины и аргинины, и немного пептидную связь. Если подобрать более менее адекватный белок-стандарт для градуировки и работать на ее линейном участке, то кумаси позволяет определять количество довольно прилично с вариацией процентов 10. Но не размер, а зачем вам размер у вас Лэмли по размеру разделяет. Серебро загадочно в окраске. Вот оно не любит например красить актин. Но если вам известно, как красится какой-то конкретный белок и есть чистый-стандарт белка, то можно строить градуировку по серебру. Но у серебра очень короткий участок линейности и сильная зависимость от проявления к проявлению.



    fagot-bsu /20.04.2008 08:16/
    1) Не могли бы вы указать состав раствора в котором необходимо вымочить гель при сушке, единственный раствор указанный в тех методиках на метаноле, а работать с етим реактивом ни желания ни возможности. У меня есть глицерин, уксусная кислота и этиловый спирт

    2) позволю себе не согласиться, концентрирование однозначно происходит при переходе концентрирующий разделяющий, ето объясняется скачком подвижности обусловленным:

    -разной пористостью
    -разной молярностью буфера
    -перераспределением заряда между трисом и глицином в концентрирующем геле, в результате чего большая часть глицина пришедшего на смену хлорид-аниона превращается в цвиттер-ион (два последних повышенная напряженность в концентрирующем геле)

    см. Остерман ("... назначение формирующего геля- собрать смесь белков в узкую полосу, толщина которой может составлять сотые доли миллиметра, независимо от объема исходного препарата. Для рабочего геля она является исходной зоной фракционирования, что резко повышает его разрешающую способность)

    3) Я неправильно выразил свою мысль. Я вообще- то хотел спросить можно ли построить калибровку окрашенности от КОЛИЧЕСТВА белка. По кумасси получилось, а вот ссеребром проблема, если кто-то делал нечто подобное пожалуйста отзовитесь. Или просто посоветуйте метод с высокой линейностью и воспроизводимостью (время окраски не существенно).



    guest: ммм /21.04.2008 13:44/
    1) Можете смело использовать 40% этанол 3% глицерин остальное вода. Гель сжимается если использовать 20% спирт сжатие меньше. Так же можно использовать 20% ПЭГ 4000 или 10000 или даже ПЭГ115(это торговая марка промышленного продукта, на самом деле это ПЭГ 4000-5000). В спиртовых раствора при увеличении процентности геля надо увеличиват концентрацию глицерина начиная с 12-15 процентного геля нужно использовать 5-7% гдицерин.

    2)Вы несовсем правы, но для обяснения недостаточно места на полях этого форума.
    3) С кумаси возможно. Да и серебром наверное возможноглавно подобрать условия.



    Гость /21.04.2008 15:31/
    Вопрос глупый-глупый - а TGB 5х, это его перед использованием розбавить надо? Извените.



    guest: ммм /21.04.2008 17:29/
    --Вопрос глупый-глупый - а TGB 5х, это его перед использованием розбавить надо? Извените.

    А в каком контексте вы это читате. И что сие буквосочетание значит.

    SSС 20х , а разводят чаще всего в 5 раз smile.gif

    Состав 5хTGB в студию, тогда и поговорим.



    guest: Гость /22.04.2008 12:42/
    А спасибо Вам за ответ, я просто немножко 5х перед TGB не заметила, ну и все из этого вытекающее.. :mol: :wall: :) . Я больше такое спрашивать не буду...



    Почему /22.04.2008 15:26/
    У меня при окраске на форезе (если не доганять до конца) остаються полосы горизонтальные при отмывке они темного цвета, выглядит как-будто нижний и верхний буферы не дошли до места встречи, почему это так и куда это можна деть?



    guest: ммм /22.04.2008 16:36/
    --У меня при окраске на форезе (если не доганять до конца) остаються полосы горизонтальные при отмывке они темного цвета, выглядит как-будто нижний и верхний буферы не дошли до места встречи, почему это так и куда это можна деть?

    В смысле в самом конце, геля? Если так, то это просто развал и низкомилекулярная фракция, ее можно выгнать вместе с БФС, а можно оставит на любителя.



    fagot-bsu /27.04.2008 20:59/
    Пжалуйста подскажите метод окраски серебром, который характеризуется прежде всего повышенной воспроизводимостью и линейностью, если вы еще и укажите диапазон в котором ента линейность наблюдается то это будет просто замечательно.
    Очень жду вашего ответа и буду за него благодарен.



    guest: ммм /28.04.2008 11:07/
    --Пжалуйста подскажите метод окраски серебром, который характеризуется прежде всего повышенной воспроизводимостью и линейностью, если вы еще и укажите диапазон в котором ента линейность наблюдается то это будет просто замечательно.
    Очень жду вашего ответа и буду за него благодарен.

    К сожалению не могу сказать ничего определенного. Мы в лабе пользуемся окраской аммиакатами. Воспроизводимость при любой окраске(не только серебром) никакая, поэтому обычно пробу гоняют одновременно с раститровкрой градуировочного белка на одном геле.

    Чувствмтельность окраски аммиакатами, зависит от концентрации исходного нитрата серебра, и от сенсибилизации геля формалином или глютаром. И колеблется от 0.1нг до 1нг (реально воспроизводится 0.5-1нг) на зону. Что касается линейности, то она соблюдается до нг 10-50. Но как чувствительность, так и линейность еще очень сильно зависит от "личного отношения" конкретного белка к окраске серебром.



    Гость /08.05.2008 19:25/
    SDS-PAGE все-таки, наверное, правильнее, хотя на полимеризацию это не влияет :)



    Cruel /15.05.2008 16:34/
    А нужно ли подвергать воздействию 95С 5мин образец, денатурированный в 8М мочевины? Т.е. получается, что денатурация в этом случае проходит дважды?



    bukach /16.05.2008 00:43/
    (Cruel @ 15.05.2008 16:34)
    Ссылка на исходное сообщение  А нужно ли подвергать воздействию 95С 5мин образец, денатурированный в 8М мочевины? Т.е. получается, что денатурация в этом случае проходит дважды?

    не то что бы не нужно, но нежелательно. но не из-за "дважды денатурации", а карбамоилирования и пр.



    Cruel /19.05.2008 13:35/
    не то что бы не нужно, но нежелательно. но не из-за "дважды денатурации", а карбамоилирования и пр.


    тогда я могу эти образцы смешивать с 5хsds-page sample buf. и наносить? т.е. получается, что белки побегут в обычном белковом геле? я имею ввиду, что в геле нет мочевины и пр.



    guest: ммм /19.05.2008 18:00/
    -- нужно ли подвергать воздействию 95С 5мин образец, денатурированный в 8М мочевины? Т.е. получается, что денатурация в этом случае проходит дважды?

    Если хотите восстановить S-S связи, то придется. Или ждать пока они востановятся сутки, другие.

    Несмотря на
    --"карбамоилирования и пр."


    Я бы кипятиил в SDS, а потом сыпал бы сухую мочевину, до нужной концентрации.

    -тогда я могу эти образцы смешивать с 5хsds-page sample buf. и наносить?

    Ага, у вас образцы по ходу, до анализа в мочевине.
    Ага, меня всегда весилил 5х буфер растворимый только при 60 градусах.
    Можете добавить SDS чуть-чуть(0.1-0.2%) и глицерина для плотности. Не нужен вам там ведерный SDS. Просто в 8М мочевине SDS с белками практически не вяжется и его присутствие в пробе, по большому счету ничего не решает.

    -- т.е. получается, что белки побегут в обычном белковом геле? я имею ввиду, что в геле нет мочевины и пр.

    Если в геле будет мочевина, то это уже не будет Лэмли форез. SDS не будет связываться с белками и они будут делится не по массе, а по массе и заряду. К тому же щелочные белки вообще не войдут в гель при таком раскладе. Возможны и более размытые зоны.

    У вас мочевина останется в кармане. А белочек будет входить в гель без нее. Если SDS-а не хватит, что бы растворить белок(а SDS из пробы и ЭБ будет сквозь мочевину со свистом пролетать) при вхождении в гель будут осадки(шлейфы от кармана по гелю в концентрирующем и начале разделяющего геля). С другой стороны очень много SDS в геле и в ЭБ будут рождать артефакты. Так что если будут осадки, то можно просто повысить концентрацию SDS в пробе. Возникновение осадков зависит от концентрации белка в пробе и от его личной вредности агрегировать из денатурированного состояния.



    Cruel /20.05.2008 11:29/
    Здрасте ВСЕ!!!

    Спешу поблагодарить ответивших на мои предыдущие посты - спасибо ребята!

    теперь вот,

    состав моих:

    30% acrylamide/0,8 bis-acrylamide;

    2.5x separating gel buffer: 1.875 M Tris·Cl, 0.25% SDS pH 8.9;

    5x stacking gel buffer: 0.3 M Tris·phosphate, 0.5% SDS pH 6.7;

    5x electrophoresis buffer: 0.5 M Tris, 1.92 M glycine, 0.5% SDS pH 8.8;

    5x SDS-PAGE sample buffer: 0.225 M Tris·Cl, pH 6.8, 50% glycerol, 5% SDS, 0.05% bromophenol blue;

    делаю пробы так: 1 объем 5x SDS-PAGE sample buffer и 4 объема образца.

    В методике написано, что после смешивания пробу можно наносить.

    Вопрос: надо ли мне эти пробы кипятить? если образец: белок + (100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris·Cl, 8 M urea pH to 8.0).

    мое мнение: не нужно.



    guest: ммм /20.05.2008 13:11/
    SH- реагентов нет, значит не нужно.



    Cruel /20.05.2008 14:12/
    благодарствую Вам премного.
    просто иногда как-то клинит, вроде все понятно, а получается, что надуманно.



    Дюймовочка /28.05.2008 22:39/
    Посоветуйте, плз!!! Я пищевик и пришлось столкнуться с электрофорезом и что-то не клеится!!! tongue.gif Я выделяю белки изо ржи: сначала водорастворимые, затем солерастворимые - 10% NaCl, щелочерастворимые - 0,1 М NaOH и на последней стадии спирторастворимые-70% этанолом. Образцы белков храню в морозильнике перед проведением фореза. Использую разрешающий гель 10%, а концентрирующий-4%. Белки гоню при 15 V и 80А. Затем гель достаю из стекол, промываю дистил. водой и сразу провожу окрашивание готовой краской кумаси. После окрашивания геля дорожки получаются размытыми и неровными. А в другой раз и вообще на некоторых дорожках белков и не видно. weep.gif У меня крутятся в голове мысли, что может краска плохая или может быть экстрагенты как то влияют? Или еще что-то..... confused.gif Помогите, плз! wink.gif



    Дюймовочка /28.05.2008 22:46/
    И еще вопросик насколько точно определяется концентрация белка биуретовым методом? И все ли белки можно им определить? Или может стоит рассмотреть определение концентрации белка другим методом???? Заранее спасибо!!! smile.gif



    guest: ммм /29.05.2008 12:54/
    Миллиметровочка! Ток 80А - это ток электросварки, при таком токе гель, не то что закипит, он прямо таки взорвется испаряясь.

    НО! Даже если учесть, что Миллимитровочка описалась и это всего лишь 80mA, для 15V ток великоват. Доложите какое у вас общее сечение и длина геля.

    --После окрашивания геля дорожки получаются размытыми и неровными.
    Неровными это как? Извилистыми, чи шо?
    Если извилистые, то вы, Миллимитровочка, плохо исходный раствор для геля перемешиваете.

    -- А в другой раз и вообще на некоторых дорожках белков и не видно.
    А от того и не бачите, шо нема. Я лично сильно сомневаюсь, что на 10% геле будут видны белки растворимые в 70% спирте, они скорее всего уйдут с фронтом.

    -- У меня крутятся в голове мысли, что может краска плохая
    Это вряд ли, но можете попробовать перед окраской вымочить гель в 40% спирте(или метаноле).
    -- или может быть экстрагенты как то влияют?
    Еще как, При чем все вами описанные. Соль сильно размывает зоны и дает шмеры. Щелочь по идее тоже должна размывать зоны. А спиртовые белки могут выпадать в осадок при входе в гель.
    ---Или еще что-то.....

    Да много чего. Например, качество акриламида, бис'а, Трис'а, SDS и глицина.

    А так же правильность рН в буферах для геля.



    guest: Гость /05.06.2008 22:04/
    Спасибо большое за ответ! smile.gif
    Доложите какое у вас общее сечение и длина геля.
    Длина геля где-то 7 см, ширина - 8 см, а толщина где-то 2 мм.
    Соль сильно размывает зоны и дает шмеры. Щелочь по идее тоже должна размывать зоны. А спиртовые белки могут выпадать в осадок при входе в гель
    Может быть стоит попробовать выделить белки экстрагентами в более низких концентрациях??? Или не поможет? wink.gif



    Гость /20.07.2008 13:13/
    подскажите, пожалуйста, какова должна быть концентрация белка для SDS-PAGE, чтобы его можно было без проблем увидеть, а то после ионообменной хроматографии делаем форез, и ничего не получаем, хотя доподлинно известно, что перед хроматографией белок был.
    и вопрос второй: на каком вольтаже нужно гнать гель?



    Гость /21.07.2008 14:46/
    Для биохимиков, который занимаются электорофорез растворимых белков. Как можно определить концентрация белков при выделения и равномерно давать к каждому лунку.Если можно конкетно описать. Е. Заранее спасибо!!!



    Knizhnik /21.08.2008 23:41/
    Подскажите пожалуйста, бывало ли у кого-нибудь такое, что белковый фронт доходит до 15 кДа, а дальше не идет, хотя краска идет. С чем это может быть связано? Все гоню в 15% геле, так как нужный белок 16 кДа. Спасибо, заранее.



    НЮСЛИК /02.10.2008 12:55/
    подскажите пожалуйста, разгоняет ли кто-нибудь на этом свете молочные белки? просто беда какая-то с ними...... :weep:



    guest: ммм /02.10.2008 13:47/
    подскажите пожалуйста, разгоняет ли кто-нибудь на этом свете молочные белки? просто беда какая-то с ними......

    Ктон -нибудь разгоняет, но не я. А беда от того что нада казеин сначало створожить.



    НЮСЛИК /03.10.2008 09:04/
    что створожить-это само собой. это ясно. вот только как на фракции казеин разобрать. вот в чем вопрос. и как сыворочные белки по отношению к казеиновым себя ведут. помогите кто-нибудь rolleyes.gif



    guest: ммм /03.10.2008 14:01/
    --вот только как на фракции казеин разобрать.
    Какие фракции? Чем фракции отличаются, тем способом и разделять.
    --и как сыворочные белки по отношению к казеиновым себя ведут.
    Никак, плавают в молоке. В чем ваш вопрос?



    нюслик /16.10.2008 08:55/
    мне нужна методика выделения и идентификации белков молочного происхождения. может быть так понятнее будет. подскажите, пожалуйста, если кто-нибудь знает. confused.gif



    guest: ммм /16.10.2008 13:51/
    -может быть так понятнее будет.

    Нет так еще непонятнее будет. Сколько белков столько методов как выделения, так и идентификации.

    Например лактопероксидазу можно просто по активности цветной реакцией определять. Имуноглобулины А имунохимически. Ну и тд.



    aed1986 /19.11.2008 14:03/
    Здравствуйте!
    Хочу провести электрофорез гуминовых кислот, но никак не могу найти методику. Если есть такая информация, пожалуйста поделитесь!



    guest: plotter /27.11.2008 16:50/
    Народ, два раза подряд одинаковая херь. Заливаю разрешающий, полимеризуется. Заливаю концентрирующий. После типа полимеризации вытягиваю гребенку (камера уже в буфере стоит) и весь конц. гель превращается в кашу. Ессено что туда уже ничего не внесешь и час ушел в пустую. Почему такая фигня?
    Камера хеликоновская (течет кстати жутко, лучше покупайте биорад), гребенки вроде тефлоневые, прилипать не должны...



    guest: ммм /27.11.2008 20:01/
    --Народ, два раза подряд одинаковая херь. Заливаю разрешающий, полимеризуется. Заливаю концентрирующий. После типа полимеризации вытягиваю гребенку (камера уже в буфере стоит) и весь конц. гель превращается в кашу.

    Скорее всего Бис подразвалился или ПСА(ТЕМЕД) протухли.



    plotter /28.11.2008 12:25/
    Бис был одолжен в соседней лабе (у них все ОК). Темед и пса новые совершенно (aps сухой в морозилке стоит) темед воняет темедом, как положенно (да и конц гель-то полимеризуется как положенно).



    plotter /28.11.2008 14:00/
    кстати, а на сколько приемлемо заменять пропанол бутанолом?



    guest: ммм /28.11.2008 18:45/
    --Бис был одолжен в соседней лабе (у них все ОК). Темед и пса новые совершенно (aps сухой в морозилке стоит) темед воняет темедом, как положенно (да и конц гель-то полимеризуется как положенно).

    Ну, у меня больше нет мыслей, кроме как: концентрации не соблюдены, или набор кривой, или руки кривые.

    Я бы все же начал с проверки Биса вполне возможно, что вам дали вовсе не тот что был в бутылочке, которой пользуются.

    Разделяющий гель концентрированей концентрирующего и поэтому там не так заметно ухудшение механических свойств геля - это естественно.



    guest: ммм /28.11.2008 18:46/
    --кстати, а на сколько приемлемо заменять пропанол бутанолом?

    В бензобаке автомобиля - приемлимо, а вы про что спрашиваете?



    plotter /29.11.2008 17:12/
    Про заливку разрешающего геля на время полимеризации буттиловым спиртом вместо пропилового. (по принципу чем богаты...)



    guest: ммм /01.12.2008 14:07/
    --Про заливку разрешающего геля на время полимеризации буттиловым спиртом вместо пропилового.

    Так там можно даже дистиллятом наслаивать. А бутанол(изобутанол) даже удобней, он с водой не смешивается.



    bsm /02.12.2008 21:35/
    Коллеги подскажите, меркаптоэтанол в белковом растворе должен присутствовать обязательно, или могут быть варианты... и как скажется его отсутствие на активности различных ферментов в геле.
    Спсб.



    Olga Vik /02.12.2008 22:03/
    (bsm @ 02.12.2008 21:35)
    Ссылка на исходное сообщение  Коллеги подскажите, меркаптоэтанол в белковом растворе должен присутствовать обязательно, или могут быть варианты... и как скажется его отсутствие на активности различных ферментов в геле.
    Спсб.


    вроде в геле уже нет ничего активного eek.gif

    если не ошибаюсь, меркаптоэтанол способствует денатурации (наряду с SDS): под его воздействием происходит восстановление дисульфидных связей, что предотвращает выпетливание денатурированных полипептидов и повышение их подвижности. читала статью, в которой его специально не добавляли - такой "неденатурирующий" форез, использовали для проверки на наличие дисульфидных связей.



    bsm /02.12.2008 22:10/
    есть информация, что меркаптоэтанол в небольших кол-вах (1-5%) добавляют в исследуемый раствор ферментов для предотвращения их от окисления и образования дисульфидных мостиков! Что как я полагаю может грозить потерей активности различных форм ферментов и как следствие их не проявлением. Поправьте если ошибаюсь.



    Olga Vik /02.12.2008 23:01/
    (bsm @ 02.12.2008 22:10)
    Ссылка на исходное сообщение  есть информация, что меркаптоэтанол в небольших кол-вах (1-5%) добавляют в исследуемый раствор ферментов для предотвращения их от окисления и образования дисульфидных мостиков!

    вообще-то это тема по электрофорез белков, поэтому сразу уточнить стоило о чем спрашиваете =)
    только вот про "активность белков В ГЕЛЕ" так и не поняла... confused.gif



    bsm /02.12.2008 23:30/
    выявление изоферментов посредством помещения геля (естественно после разгонки smile.gif ) в субстрат.



    Olga Vik /02.12.2008 23:36/
    (bsm @ 02.12.2008 23:30)
    Ссылка на исходное сообщение  выявление изоферментов посредством помещения геля (естественно после разгонки smile.gif ) в субстрат.

    smile.gif



    bukach /02.12.2008 23:42/
    отсутствие меркаптоэтанола/ДТТ может повлиять, а может и не повлиять. зависит от фермента. некоторым белкам от восстановителей наоборот кранты приходят. в основном это секретируемые белки, они часто зашиты дисульфидными связями (например инсулин, иммуноглобулины, лактальбумины).

    полагаю, что в гель МЭ добавить не получится - он не должен полимеризоваться. ПСА пойдёт на окисление МЭ, а не на полимеризацию акриламида.
    есть наверное заряженные восстановители, которые можно добавить в електродный буфер, если форезная система гомогенная (одинаковые буферы в геле и электродный), то и загнать прераном. вообще, преран лучше сделать, чтобы избавиться от остатков ПСА и растворы дегазировать - меньше кислороду - меньше окисления.

    а проверить влияние восстановителей на ваш фермент можно?



    bsm /03.12.2008 00:36/
    Дело в том, что исследуется внутриклеточный гомогенат ( в котором ессесено присутствуют протеиназы и другие нехорошести разные smile.gif ) вот и возник вопрос поможет ли мне меркаптоэтанол снизить влияние всяких нехороших вещей на ферменты (хотя бы на какое-то время) confused.gif



    guest: ммм /03.12.2008 17:32/
    --поможет ли мне меркаптоэтанол снизить влияние всяких нехороших вещей на ферменты (хотя бы на какое-то время)

    Легче проверить, чем дать априорный адекватный ответ.



    bsm /03.12.2008 20:00/
    Да я понимаю. Но мало ли может кто-то сталкивался smile.gif . Бум проверять!



    guest: ммм /03.12.2008 20:29/
    bsm!!!!! Меркаптоэтанол в колличестве 1-10 % в SDS электрофорезе добавляют не для сохранения активности ферментов. Надеятся на сохранение активности при кипячении с 2% SDS, особо нет ни каких причин, а для разрушения мостиковых S-S связей между субъединицами белков. Для сохранения активности концентрация SH-реагентов обчно 1 иногда 5-10мМ и не более 50mM.



    Гость /03.12.2008 21:33/
    Всем привет, такой вопрос если необходимо приготовить вертикальный гель с непрерывным градиентом толщиной 6 мм, как его лучше заливать в центр или с краю...
    Допустим, не буду ли я иметь сдвиг градиент вниз у центра, если заливаю из миксера в центр?



    Гость /03.12.2008 21:39/
    Всем привет, такой вопрос если необходимо приготовить вертикальный гель с непрерывным градиентом толщиной 6 мм, как его лучше заливать в центр или с краю...
    Допустим, не буду ли я иметь сдвиг градиент вниз у центра, если заливаю из миксера в центр?



    guest: ммм /04.12.2008 16:17/
    Если вам так страшно поставте модельный эксперимент, добавив в один из градиентообразующих растворов какого-нибудь бромфенолового синего.

    А так мое мнение такой 3% глицерин в оба раствора и не спешить с заливанием. А с какого краю в общем пофигу.



    Гость /08.12.2008 17:12/
    всем привет! помогите! делаю форез сывороточных белков-все хорошо,но белки входя в разделяющий гель вдруг останавливаются,непонятно то ли они теряют заряд,то ли что....хотя при проведении фореза БФС пробежала до конца...буфер нужной концентрации,возможно концентрация геля какая-то не такая? посоветуйте что-нибудь!



    plotter /08.12.2008 18:34/
    Я рэбитчью сыворотку в 7,5% геле гонял. Помоему это маловато. Лучше брать 10 или градиент.



    Raido /09.12.2008 14:24/
    Здравствуйте! У меня такая проблема: при разделении в 8% ПААГ-SDS фракция белков массой меньше 35 кДа "ложится" на фронт, не разделяясь, что значительно затрудняет (и даже делает невозможным) их дальнейший анализ с помощью Вестерн блоттинга. Подскажите, пожалуйста, с чем может быть связано наблюдаемое явление?



    Эмин /11.12.2008 04:10/
    Наверное, это связано с тем, что 8% недостаточно для разделения белков массой меньше 35 кДа.



    Raido /11.12.2008 04:46/
    Я тоже так думала, но самое интересное, что фирма-производитель маркера приводит изображение линейки его разделения до белка в 10 кДа для 8 - 16% геля...что, в общем-то, соответствует данным таблицы "выбора % разрешающего геля" (см. выше). Может ли рН разрешающего геля (Tris-HCl), который не 8.8, а 8.6 быть причиной наблюдаемого явления?



    Guest /11.12.2008 12:28/
    Так то для градиентного геля. Хотя все равно странно. Белок какой массы Вам нужен и почему считаете, что белки до 35 не разделяются?



    Гость /12.12.2008 09:47/
    Около 20 кДа. А вывод о том, что белки ниже 35 кДа не разделяются был сделан из наблюдения за "поведением" маркера: белки маркера массой менее 35 кДа идут в месте с фронтом.



    Raido /12.12.2008 10:01/
    Около 20 кДа. А вывод о том, что белки ниже 35 кДа не разделяются был сделан из наблюдения за "поведением" маркера: белки маркера массой менее 35 кДа идут в месте с фронтом.



    Гость /12.12.2008 12:51/
    Помогите, пожалуйста! пробы проходят через концентрирующий гель и входят в разделяющий, но останавливаются на самом верху геля и дальше не идут и нет разделения(( краска идет нормально. маркер сигмовский тоже не разделяется. смесь акриламида с бисом свежая, биорадовская.



    plotter /12.12.2008 14:04/
    3kDa в каком геле гнать? Я в догадках...



    guest: ммм /12.12.2008 17:19/
    -3kDa в каком геле гнать? Я в догадках..

    А зачем? Можно HPLC или после ультрофильтрации в нативном геле при рН близкизх к рI только расплываться будет сильно.



    guest: ммм /12.12.2008 17:22/
    --Помогите, пожалуйста! пробы проходят через концентрирующий гель и входят в разделяющий, но останавливаются на самом верху геля и дальше не идут и нет разделения(( краска идет нормально. маркер сигмовский тоже не разделяется. смесь акриламида с бисом свежая, биорадовская.

    По моему вы перепутали верхний и нижний буфера. или забыли SDS в электродном буфере, но тогда обычно уже в концентрирующем начинаются тормоза.



    Гость /12.12.2008 17:30/
    ничего не перепутали, это точно. спасибо за идею про СДС, переделаю буфер.



    guest: ммм /12.12.2008 19:23/
    --ничего не перепутали, это точно. спасибо за идею про СДС, переделаю буфер.

    Ой! Дык! Мы ж з вами с одногу месту захОдте в 508к, пообщамся в реале гелёк предьявите.



    Ъ /12.12.2008 19:30/
    (guest: ммм @ 12.12.2008 18:23)
    Ссылка на исходное сообщение  --ничего не перепутали, это точно. спасибо за идею про СДС, переделаю буфер.

    Ой! Дык! Мы ж з вами с одногу месту захОдте в 508к, пообщамся в реале гелёк предьявите.

    Вот я и думаю чего это с ммм - сам с собой того чтоль... eek.gif



    Лучший /14.12.2008 00:32/
    Ставлю винду, мне пишет connect error плизз помогите поставить, в чем проблема может быть?!((



    plotter /19.12.2008 17:07/
    Сколько может храниться сухой рибофлавин? Нашел на складе запечатанные бутылочки, но они примерно мои одногодки... Какой шанс что он не потерял активность? Хранились в темноте.



    guest: ммм /19.12.2008 19:50/
    Посмотрите фарм статью или анатоцию на витаминчик.



    plotter /20.12.2008 15:22/
    Посмотрел. Но нигде не написанно как долго он может храниться в сухом (видимо лиофилизированном) виде.



    220 /16.01.2009 14:55/
    Вопрос о трудностях процесса!
    Есть проблема: после окрашивания на дорожках, соответствующих нанесенным препаратам из корневищ одного цветика (грубому экстракту и после гель-колонки) вообще ни фига нет (ничего не прокрасилось), хотя концентрация белков в обоих случаях была около 2 мг/мл. При этом маркеры отлично разделялись, неплохо прокрасились и шли ровной полосой, в то время как дорожки с образцами сильно размазывались и уширялись к низу. Проверяли уже все: и гели и буферы, но итог тот же. Грубый экстракт получали после высаливания сульфатом, но ведь суточный диализ был..., вроде соли при проверке не было. Может, каким-то образом на образцы влияют полисахариды, кот-е в них есть или какие-то другие не учтенные соединения? В общем, пока ситуация немножко тупика wall.gif



    guest: ммм /16.01.2009 15:51/
    -В общем, пока ситуация немножко тупика

    Как вы определяли концентрацию в 2мг/мл?

    -При этом маркеры отлично разделялись, неплохо прокрасились и шли ровной полосой, в то время как дорожки с образцами сильно размазывались и уширялись к низу.

    Как вы это узнали, если на дорожках ничего не обнаружено?

    --Грубый экстракт получали после высаливания сульфатом, но ведь суточный диализ был..., вроде соли при проверке не было.

    Как вы проверяли наличие соли. Хлоридом Бария?

    В диализе важно не время, а объем против, которого отдиализованно.



    220 to МММ /16.01.2009 16:17/
    Как вы определяли концентрацию в 2мг/мл?

    По Брэдфорд в обоих случаях.

    Как вы это узнали, если на дорожках ничего не обнаружено?

    Это на дорожках с нанесенными образцами в итоге ничего не видно, а маркеры после фиксации (гель фиксировали 20% ТХУ) и прокрашивания геля были разделены и картинка была очень даже ничего. Тут есть еще один момент, возможно связанный с красителем: после окрашивания (ночь) картинка стала появляться только при отмывке уксусной кислотой, до этого гель был равномерно прозрачно-голубым.

    Как вы проверяли наличие соли. Хлоридом Бария?

    В диализе важно не время, а объем против, которого отдиализованно.

    Ну да, хлоридом бария shuffle.gif Что касается объма, то диализ вели с 4-х кратной сменой по 500 мл.



    guest: ммм /16.01.2009 16:31/
    Неужели, у вас после диализа ничего не выпало. А концентрацию вы измеряли до дитализа или после?
    И и сколькими процентами насыщения СА проводили экстракцию?



    Гость 220 to МММ /16.01.2009 16:44/
    Ну да, после диализ выпал таки осадок (диализ против дистиллята). А высаливали при 80% насыщении. Концентрацию мерили уже после диализа.



    guest: ммм /16.01.2009 16:55/
    --в то время как дорожки с образцами сильно размазывались и уширялись к низу.

    Это как вы узнали? Если на них ничего небыло.

    Где то у вас промах.

    Сомнение N1
    Не верю я, что после экстракции 80% СА и после диализа и выпадения. Осталось такая высокая концентрация 2мг/мл.
    Сомнение N2
    Возможно у вас идет сильный протеолиз, а гель довольно низкой процентности вот все во фронт и убежало.



    wormball /18.01.2009 19:48/
    Господа, а как вы герметизируете камеру? Вакуумная смазка не устраивает в силу геморроидальности отмытия.

    И с помощью чего вы регистрируете и обрабатываете результаты?

    Заранее благодарен.



    guest: ммм /19.01.2009 16:53/
    --Господа, а как вы герметизируете камеру?

    Герметизировать камеру опасно ибо во время э/ф выделяется водород и кислород, которые могут взорваться.

    Если вы имеете ввиду герметизацию электродных емкостей то это зависит от конструкции, но обычно там либо она не требуется либо с помошью резиновой прокладки и зажима.

    --И с помощью чего вы регистрируете и обрабатываете результаты?

    Вас интересует soft или аппарат перевода на физический/цифровой носитель или окраска?
    окраска: кумаси/серебро
    перенос в компьютер: сканер/фотоаппарат
    soft: например ImageJ



    wormball /20.01.2009 04:35/
    Если вы имеете ввиду

    Я имею в виду непосредственно ёмкость, в которую заливается гель.

    Вас интересует soft или аппарат перевода на физический/цифровой носитель или окраска?

    Прежде всего софт, ибо ImageJ не понравился тем, что выдаёт результаты исключительно в форме рисунков (причём с довольно низким разрешением по яркости), а другие программы, упомянутые в соседнем топике, не бесплатны. Аппарат также интересует, в частности, чем и насколько лучше "фирменные" решения за бешеные бабки, нежели цифромыльница в совокупности с самодельной подсветкой. Окраска у нас кумасси, а серебро лучше?

    сканер

    Интересная мысль.. Токмо надо опять же изобретать просвечивающую подсветку. Или же есть сканеры с готовой лампой формата хотя бы А5?

    Также зело интересует вопрос о том, на что в первую очередь грешить, ежели полосы почти не разрешаются. Выделяем белки из лейкоцитов (желатин, центрифуга, PMSF), далее всё "по Лэммли". Вода разве что обычный дистиллят в силу отсутствия чего-либо лучшего.



    vb /20.01.2009 05:21/
    (wormball @ 20.01.2009 01:35)
    Ссылка на исходное сообщение 
    Интересная мысль.. Токмо надо опять же изобретать просвечивающую подсветку. Или же есть сканеры с готовой лампой формата хотя бы А5?


    просвечивающая - здорово. но в большинстве случаев не нужна. пользуем обычный сканер hp3300



    guest: ммм /20.01.2009 17:57/
    --Я имею в виду непосредственно ёмкость, в которую заливается гель.
    Ах! Вот вы о чем. Ну у мене спец камера там просто заглушка стоит вроде боковой прокладки.
    А так, Агароза 4 ever!!!

    --ImageJ не понравился тем......

    Ну крякните этот платный софт или напишите свой.

    --Аппарат также интересует, в частности, чем и насколько лучше "фирменные" решения за бешеные бабки, нежели цифромыльница в совокупности с самодельной подсветкой.

    По качеству результата ничем, а так удобство и быстрота, но не супер те не во столько раз во сколько дороже.

    --Или же есть сканеры с готовой лампой формата хотя бы А5?

    Есть конечно, у кэнона и эпсона точно есть.

    -о том, на что в первую очередь грешить, ежели полосы почти не разрешаются.

    На процентность геля: если маленькие белки не разрешаются, процентность надо увеличить, если большие, то уменьшить. Это в первую очередь. Во вторую на акриламид, тогда его надо деионизовать. Ну и в последнюю очередь буфера.

    --а серебро лучше?
    Дороже, капризней на порядок-два чувствительней.



    Alenike /21.01.2009 13:16/
    кто сталкивался с такой вещью: при делении белков 2Д форезом с использованием стрипов, либо кислая, либо щелочная сторона не делятся, получаются вертикальные полосы или все размыто, а середина геля разделяется хорошо- белок к белку. такой полосатый гель получаем. На что тут думать? shuffle.gif



    guest: ммм /21.01.2009 14:42/
    1) стрипы загавнились или изначально по краям с плохим разрешенем
    2) либо слишком долго гнали(щелочные слипаются кислые расходятся) либо слишком рано перестали гнать щелочные делятся кислые слишись.
    3) Аналит и католит шпортились.



    Knizhnik /21.01.2009 21:46/
    Подскажите пожалуйста, заливаю 15% SDS-PAAG, а фронт идет вместе с полосой маркера 17 кДа, а мне нужен белок 15 кДа. Раньше ставила, все получалось, отделялась полоса маркера 12 кДа, а сейчас нет и все. В чем может быть проблема?



    guest: ммм /21.01.2009 22:09/
    --Раньше ставила, все получалось, отделялась полоса маркера 12 кДа, а сейчас нет и все. В чем может быть проблема?

    Поменялася стоковый раствор акриламида. Поменялась концентрация Биса.



    Knizhnik /21.01.2009 22:14/
    --Раньше ставила, все получалось, отделялась полоса маркера 12 кДа, а сейчас нет и все. В чем может быть проблема?

    Поменялася стоковый раствор акриламида. Поменялась концентрация Биса.

    сток тот же пробовала,сегодня его переделала, поставила - опять тоже самое:( пробовала менять TGB, APS, TEMED - не помогает! может переделать TrisHCl pH 8,8 и 6,8 для разрешающего и концентрирующего гелей??



    wormball /22.01.2009 02:58/
    (guest: ммм @ 20.01.2009 17:57)
    Ну крякните этот платный софт или напишите свой.

    Может быть, действительно стоит написать.. А кряков я не нашёл. Какую из них крякать?

    Есть конечно, у кэнона и эпсона точно есть.

    А можно конкретные модели? И используете ли вы светофильтры на 590 нм? Ежели да, то где их взять? Появилась также мысль использовать натриевые лампы низкого давления, благо они светят как раз на требуемой длине волны, однако сия идея сдерживается трудностями в нахождении пускорегулирующих аппаратов для оных ламп.

    На процентность геля: если маленькие белки не разрешаются, процентность надо увеличить, если большие, то уменьшить.

    Не, они все не разрешаются. Просто идёт сплошная синяя полоса и на ней от силы 10 пиков. Белки самые средние.

    Во вторую на акриламид, тогда его надо деионизовать.

    А чем и как его деионизировать? А перекристаллизовать не пойдёт?

    Ну и в последнюю очередь буфера.

    Кстати, про буфера. Не подскажете, какой и где купить электрод для рН-метра? И как его хранить? Аппарат mettler toledo 320 ph meter.



    guest: ммм /22.01.2009 13:32/
    --А кряков я не нашёл. Какую из них крякать?
    Totallab.Напишите в раздел форума про биософт вам скорее всего помогут.
    -А можно конкретные модели?
    НЕТ! У меня старый а ползать по сайтам производителей и делать вашу работу мне лень.
    -И используете ли вы светофильтры на 590 нм?
    Я? Нет! И такой узкополосный фильтр не нужен, можно просто купить старый советский ораньевый фильтр в комиссионке или на развалах в Измайлово, а можно фирменный от Мурами или Кенко на foto.ru или в Сивме.
    -Не, они все не разрешаются. Просто идёт сплошная синяя полоса и на ней от силы 10 пиков. Белки самые средние.
    Тут могут проблемы в пробе, например высокая соль, или большое количество протеаз. Но и в акриламиде и в буферах тоже может быть дело.
    -А чем и как его деионизировать?
    Смолой ионообменной, примерно так же, как деионизируют воду. Смолы могут быть разные, например уже готовая смесь продает DOW, Purolight(не уверен, что правильно написал) но они одноразовые. а можно использовать последовательно сухие катионит и анионит в Н+ и ОН- формах соответственно из советских КУ 2-8 и АВ 17-8 Есть их аналоги у выше названных забугорных супостатов цены их отличаются не сильно.
    -А перекристаллизовать не пойдёт?
    Подойдет, но на мой взглят муторнее и не так эффективно. Перекристализация хороша для уборки желтезны.
    -Не подскажете, какой и где купить электрод для рН-метра? И как его хранить? Аппарат mettler toledo 320 ph meter.
    НЕ знаю, мне хватает Белорусского ЭСЛ 43(63) но у него разъем другой.



    wormball /27.01.2009 21:53/
    (guest: ммм @ 22.01.2009 13:32)
    Ссылка на исходное сообщениеСмолой ионообменной, примерно так же, как деионизируют воду.

    К стыду своему никогда не деионизировал ни воду, ни что-либо ещё. Где про это следует читать?

    Перекристализация хороша для уборки желтезны.

    Кстати говоря, никто часом не знает, откуда берут хлороформ? А то он оказывается запрещённый. Акриламид, бромистый этидий и т. п. не запрещённые, зато хлороформ запрещённый.

    Посмотрел в магазинах акриламид. Есть 500 грамм за 1100 рублей либо 500 грамм за 4700 рублей. Критичен ли выбор из этих двух акриламидов для качества электрофореза?

    Также следующий вопрос. Полосы на геле каким-то чудом стали проявляться, но теперь начальник утверждает, что раньше картина распределения белков была другая, т. е. одни белки обгоняют другие, которых в норме они якобы не должны обгонять. Он утверждает, что это всё вследствие того, что акриламид напитал в себя воды и посему гель получается слишком разбавленный. В то время как я почему-то думаю, что результаты гонки между белками не должны зависеть от плотности геля, и грешу либо на акриловую кислоту, либо на СДС, либо на недостаточную тщательность процедуры выделения белков, в частности, недостаточную продолжительность кипячения. Кто из нас прав? И чем это может быть вызвано? PH 5%-го акриламида порядка 5,38, однако рН-метр наш ни к чёрту, а начальник отказывается покупать новый электрод, мотивируя это своей финансовой несостоятельностью. Гель, где я хотел посмотреть зависимость результатов от кипячения и предфореза, начальник почему-то выкинул, так и не показав мне. Я думаю, он что-то скрывает.

    Может быть, мне вовсе следует рвать когти из этого рассадника мракобесия?



    vb /28.01.2009 08:19/
    смеялся smile.gif



    guest: ммм /28.01.2009 13:38/
    --Посмотрел в магазинах акриламид. Есть 500 грамм за 1100 рублей либо 500 грамм за 4700 рублей. Критичен ли выбор из этих двух акриламидов для качества электрофореза?

    Ага! скорее всего вам нужен за 4700. А за 1100 как раз потребуется перекристализация.

    --зато хлороформ запрещённый.
    Все вопросы к МВД, хлороформ можно использовать для криминальных действий. Операцию Ы смотрели?

    Юр лицам хлороформ продают либо вообще без вопроросов, либо с бумажкой за подписью ответственного лица, в которой укзано, для чего хлороформ используется. Что бы за нал быть Юр. лицом достаточно принести доверенность от этого Юр лица на свое имя.

    -что результаты гонки между белками не должны зависеть от плотности геля.

    Не совсем так. Они могут не разрешится, те прийти к финишу одновременно, но вот, когда маленький прибегает позже большого невозможно.

    --порядка 5,38

    Но цифра ничего себе.

    --Может быть, мне вовсе следует рвать когти из этого рассадника мракобесия?

    Пожалуй, я склонялся бы к такому решению.



    wormball /29.01.2009 01:20/
    (guest: ммм @ 28.01.2009 13:38)
    Ссылка на исходное сообщениеНе совсем так. Они могут не разрешится, те прийти к финишу одновременно, но вот, когда маленький прибегает позже большого невозможно.

    Неужели совсем невозможно? А ежели, скажем, белки недостаточно денатурировали и СДС их недостаточно облепил? Или, скажем, группы акриловой кислоты в геле их тормозят?

    Юр лицам хлороформ продают либо вообще без вопроросов, либо с бумажкой за подписью ответственного лица, в которой укзано, для чего хлороформ используется. Что бы за нал быть Юр. лицом достаточно принести доверенность от этого Юр лица на свое имя.

    Но где его продают? В "научных" магазинах я не нашёл, нашёл только сайты производителей, которые находятся в Кирово-Чепецкой области и наверняка не отгружают меньше вагона.



    Vadim Sharov /29.01.2009 05:21/
    Вы в Москве?
    Я брал хлороформ в "Нева-реактиве".



    guest: ммм /29.01.2009 17:54/
    - А ежели, скажем, белки недостаточно денатурировали и СДС их недостаточно облепил?

    НЕ! Так не получится. У вас тупо все залипнет на старте потому что недоденатурировать оооочень трудно достижимо.

    -Или, скажем, группы акриловой кислоты в геле их тормозят?

    Не они некго не тормозят они просто обратный ток жидкости вызывают а в нем просто все мажится.

    --Но где его продают? В "научных" магазинах я не нашёл

    Вы смеетесь:
    На все один ответ - ХИММЕД. Но так же вы можете попробовать Мос реактив, АкадемСнаб, Дом лаверна и тд тп.



    wormball /30.01.2009 00:49/
    (guest: ммм @ 29.01.2009 17:54)
    ХИММЕД.

    Действительно. Дело всё в том, что в диа-м сказали, что хлороформа нет, ибо он запрещён, а в яндексе я натыкался исключительно на сайты производителей и на упоминания в форумах о том, что его сложно либо невозможно достать. Из вышеизложенного я сделал вывод, что дальнейшие поиски суть бесперспективняк.



    plotter /30.01.2009 12:02/
    wormball, если в пущино, то могу отлить кубиков 200 за так.



    wormball /01.02.2009 02:14/
    (plotter @ 30.01.2009 12:02)
    Ссылка на исходное сообщение  wormball, если в пущино, то могу отлить кубиков 200 за так.

    К сожалению, я не в Пущино, да и 200 кубиков, боюсь, не спасут отца русской демократии (вы ведь хлороформ имеете в виду, а не акриламид?).

    [offtop]Помнится, мы практику проходили в Пущино, зело понравилось. Какой институт? Вам часом биофизики не нужны? shuffle.gif [/offtop]



    wormball /02.02.2009 17:59/
    Кстати говоря, а где вы достаёте бумагу для самописца?



    plotter /03.02.2009 12:11/
    wormball. в биофизике тусуемсяsmile.gif Второй год мегатусни пошел. wall.gif А вы сами откуда?
    Могу в принципе и литром облагородить. Только если везти далеко...



    Guest /03.02.2009 16:24/
    Скажите почему в денатурирующих условиях (SDS) сначала белки бегут при 60 мА быстро, а на последних минутах (когда остаеться пройти 1-2 см до конца) мА падают до 28 и соответственно белок бежит очень медленно. ПОЧЕМУ???



    guest: ммм /03.02.2009 21:43/
    --Скажите почему в денатурирующих условиях (SDS) сначала белки бегут при 60 мА быстро, а на последних минутах (когда остаеться пройти 1-2 см до конца) мА падают до 28 и соответственно белок бежит очень медленно. ПОЧЕМУ???

    Потому что вы включили источник постоянного тока в режим стабилизации по напряжению. smile.gif

    А если серьезно, то это связано не с денатурирующими условиями, а с буферной системой Орнштейна-Дэвиса(или так называемой буферной системой диск-фореза).

    В начале у вас в геле 0.375М раствор трисового буфера (грубо: много соли) и следовательно высокая проводимость (низкое сопротивление) при заданном напряжении относительно большой ток. По мере движение глициновой границы по гелю весь трисовый буфер вытесняется из геля в электродную камеру, а его место в геле занимает электродный трис-глициновый буфер, в котором ионная сила и содержание соли практически никакое следовательно низкая проводимость(высокое сопротивление) и при заданном напряжении низкий ток.

    Кстати, скорость движения белка не зависит от тока напрямую, а зависит от напряженности эл поля, которое есть практически прямопропорциональная функция напряжения. Так что при заданном напряжении скорость движения белка практически одинаковая.



    plotter /10.02.2009 12:55/
    Кстати, вопрос чисто для интерса (все работает и так).
    А фронт бромфенолового должен быть тоненьким и расплывшимся? У меня он к низу расплывается почемуто. Но полосы белка все как на подбор. Почему так?



    plotter /03.03.2009 14:16/
    Как ведут себя на форезе белки после обработки солями тяжелых металлов (заингибированные)?
    От осатков соли белки отмыты.



    guest: ммм /04.03.2009 14:33/
    -А фронт бромфенолового должен быть тоненьким и расплывшимся? У меня он к низу расплывается почемуто.

    Это у вас БФС не очееннь чистый.

    -Как ведут себя на форезе белки после обработки солями тяжелых металлов (заингибированные)?

    Я думаю форез этого не заметит. Разве что металлы будут ну очень тяжелые свинец, барий, висмут.

    К томуже часть металла при кипячении в сэмпл буфере должна вооще отвалится.



    plotter /05.03.2009 12:31/
    ферментосовский маркер тоже бромфеноловым расплывается. там то он точно чистый. Да и мой, вроде как чда...



    Гость /23.03.2009 21:36/
    Два вопроса:

    1. Ксиленцианол должен бежать впереди бромфенола? (по привычке добавил еще и его)

    2. Как избавиться от синей полоски внизу геля? http://img25.imageshack.us/img25/8251/13388690.jpg ( http://img25.imageshack.us/img25/8251/13388690.jpg )



    guest: ммм /24.03.2009 19:18/
    --1. Ксиленцианол должен бежать впереди бромфенола? (по привычке добавил еще и его)

    Хороший вопрос. Для ответа на него нужно знать его изоэлектрическую точку, а мне она не известна. Но пои идее он должен бежать чуть помедленнее.

    --2. Как избавиться от синей полоски внизу геля?

    Выгнать краситель(БФС) из геля



    Гость /25.03.2009 10:11/
    > Выгнать краситель(БФС) из геля

    Кажись, ее не должно быть... В чем может быть причина этой полоски? Она не мешает разделению белков?



    guest: ммм /25.03.2009 12:17/
    --Кажись, ее не должно быть...

    Должно. Там между и внутри полосок ионов хлора и полосок инов глицина, находиртся мазня деградухи из олигопептидов.



    RRRR /28.05.2009 14:45/
    Доброго времени суток! Подскажите плз, в чем проблема: разгоняю раствор яда (2мг/мл) в биорадовской мини камере (высота пластинки разделяющего геля – 5см). разгонка начинается через 2см от края разделяющего геля и, соответственно, нижних белков нет – пластинка геля кончилась. Маркер тоже так гонится. Меняла % геля от 7,5 до 15 – не помогло. И еще. Какие параметры mA/V должны быть? Я включаю 40/200. Спасибо



    guest: guest /28.05.2009 16:20/
    значит у Вас милочка что-то не то с гелем.
    Проверьте pH буферофф и приготовте новый ПСА.



    guest: ммм /28.05.2009 16:57/
    -Подскажите плз, в чем проблема: разгоняю раствор яда (2мг/мл) в биорадовской мини камере (высота пластинки разделяющего геля – 5см). разгонка начинается через 2см от края разделяющего геля и, соответственно, нижних белков нет – пластинка геля кончилась. Маркер тоже так гонится. Меняла % геля от 7,5 до 15 – не помогло.

    Давайте без сумбура.

    Яд: какие размеры компонентов?

    Маркер: от скольки до скольки?

    Вы фронт БФС выоняете из геля или нет?

    -нижних белков нет – пластинка геля кончилась

    Что значит нет? Они не разделились или вы их выгнали из геля.

    А так похоже на то, что вы напортачили с процентностью АА. Возможно у вас просто наврана концентрация в стоке.



    RRRR /29.05.2009 05:08/
    Давайте без сумбура.

    Яд: какие размеры компонентов?

    Маркер: от скольки до скольки?

    Вы фронт БФС выоняете из геля или нет?

    -нижних белков нет – пластинка геля кончилась

    Что значит нет? Они не разделились или вы их выгнали из геля.

    А так похоже на то, что вы напортачили с процентностью АА. Возможно у вас просто наврана концентрация в стоке.
    [/quote]

    яд - большая часть - это ферменты. диапазон 14-200кДа. маркер - 11-250 кДа (ферментас). я так понимаю - поскольку они не с начала пластинки стали разгоняться - им просто не хватило места. ориентируясь по маркеру разогнались 250-55. а на 36-11 - гель кончился. АА - 30г акрила, 0,8бис-АА на 100мл воды.



    guest: ммм /29.05.2009 14:36/
    -я так понимаю ...
    Много лишнего думаете.

    У вас не та процентность акриламида. В 15% акриламиде 250 кда в любом буфере никуда не двинутся.

    От чего могут быть варианты:

    Плохо перемешали смесь пред заливкой, но тогда были бы и другие косяки.

    Ваш исходник акриламида не 30 процентный.

    Сам сухой акриламид возможно поганый. Кстаи 30 процентный мог например частично заполимеризоваться в банке, а вы сверху водичку берете почти без акриламида.

    Короче ищите вокруг процентности акриламида и будет вам счастие.



    RRRR /29.05.2009 14:42/
    Спасибо, буду искать. только я не поняла, почему в данном случае АА получился 15%? на 100мл - 30г сухого вещества - это не 30? я неправильно считаю? а сколько надо брать?



    guest: ммм /29.05.2009 16:36/
    -только я не поняла, почему в данном случае АА получился 15%?

    Никакого данного случая...

    Ваша цитата:
    --Меняла % геля от 7,5 до 15 – не помогло.

    Т.е. по вашим же словам в 15% геле 250кДа убегают на 2 см. А они даже не войдут в такой гель.



    guest: plotter /29.05.2009 17:11/
    15% это, по моему опыту, порядка 20-30kDa и никак не более. 200kDa маркер дальше 7% не уползает, хоть сутки гони. (это все для градиента)



    ужик /23.07.2009 16:11/
    Привет! кто нибудь занимается двумерным электрофорезом белков молока



    Alenka-s /05.08.2009 14:06/
    Народ, подскажите, пожалуйста, каким лучше пользоваться буфером образцов при окрашивании серебром? спасибо



    guest: ммм /05.08.2009 18:25/
    -Народ, подскажите, пожалуйста, каким лучше пользоваться буфером образцов при окрашивании серебром? спасибо.

    Стандартным. И вообще сэмпл-буфер на окраску практически не влияет. Если это не какая-то экзотика, в которой происходит химическая модификация белка(востановление SH не считается).



    Alenka-s /06.08.2009 12:13/
    (guest: ммм @ 05.08.2009 18:25)
    Ссылка на исходное сообщение  -Народ, подскажите, пожалуйста, каким лучше пользоваться буфером образцов при окрашивании серебром? спасибо.

    Стандартным. И вообще сэмпл-буфер на окраску практически не влияет. Если это не какая-то экзотика, в которой происходит химическая модификация белка(востановление SH не считается).



    огромное спасибо)



    Yolina /20.09.2009 16:41/
    Подскажите, пожалуйста, как определить концентрацию разрешающего геля для прогонки в PAAG высокогликозилированного белка, который под воздействием mercaptoethanol делится на несколько фрагментов с разным весом (70 kDa, 57 kDa, 25 kDa and 12.5 kDa)



    guest: ммм /20.09.2009 21:52/
    -как определить концентрацию разрешающего геля для прогонки в PAAG высокогликозилированного белка.

    12-13%



    Yolina /21.09.2009 14:04/
    А не страшно ли, что весовые данные фрагментов так варьируют. Войдет ли в такой гель 70kDa фрагмент?



    guest: ммм /21.09.2009 16:39/
    Yolina! Пилите. Они золотые<c>
    Страшно, не фиг здесь вопросы задавать. Нет доверия зачем спрашиваешь.

    А вообще, уверен войдет, зуб даю(с дыркой smile.gif )



    Yolina /21.09.2009 20:15/
    Спасибо, нужно очень быстро и очень точно, вот и перестраховываюсь ))



    Guest /21.09.2009 20:18/
    имха я этот зуб ( скорее всего последний ) не взял бы.
    13% имха многовато будет можно и 10% обойтись.
    Однако если хотите картинку надо градиент делать типа 9-15



    Guest /21.09.2009 20:19/
    P.S. быстро только сами знаите что бывает.



    guest: ммм /22.09.2009 08:46/
    -13% имха многовато будет можно и 10% обойтись

    В 10% 12 и 25 будут плохо выглядеть. А 70 и в 14 войдут только высоковато будет.

    -имха я этот зуб ( скорее всего последний ) не взял бы.

    А вам и не предлагают. У вас своих костей в избытке. smile.gif



    plotter /22.09.2009 11:18/
    А градинты вышли из моды? Залить 10-15% и радоваться.



    plotter /08.10.2009 20:16/
    Пара не принципиальных вопросов.
    1. А концентрация APS не завышена в этой методике?
    2. Насколько долго гель может простоять с APS но без TEMED и не заполимеризоваться?



    angel eyes The bad /08.10.2009 20:32/
    експериментальне данные 12% гель простоял примерно сутки при комнатной температуре, а потом Псеудополимеризовался"



    RRRR /09.10.2009 05:03/
    "А градинты вышли из моды? Залить 10-15% и радоваться."

    подскажите, пожалуйста, где прочитать методику как это сделать



    guest: ммм /09.10.2009 10:54/
    --подскажите, пожалуйста, где прочитать методику как это сделать
    в Остермане



    plotter /20.10.2009 15:26/
    У мну такой вопрос. Видел тут кто-то давал совет в градиент сахар добавлять. У меня потихоньку возникла такая же мысль. Короче, что если в плотный раствор градиента добавить сахарозы, скажем 10-20%. Не поможет ли это стабилизировать гель при заливке? Тобиж сделать его более однородным в горизонтальной плоскости.



    guest: ммм /20.10.2009 18:20/
    Глицерин лучше сахарозы - вязкость выше. Это способ понизить продольное перемешивание, а не поперечное. Те таким образом понижают перемешивание концентрированных слоев с менее концентрированными. Кроме того если добавлять много полиола у вас будет сдвиг рН, а если он еще и по высоте будет меняться концентрация полиола, то будет градиет рН, так даже изофокусирование делали в 80-ые годы. Обычно глицерин добавляют в густой гель до 5% не более.



    plotter /21.10.2009 12:25/
    Про поперечное я к тому, что при заливке иногда возникает формирование градиента в виде буквы V. Если вы понимаете о чем я. Вот от этого и хочу избавится.



    guest: ммм /21.10.2009 16:55/
    Поперечному это не поможет, а только помешает. Тут просто не надо торопится, когда заливаешь и все будет чики-пики.



    Vydumchik /01.12.2009 14:59/
    Товарищи! Объясните, что такое анодная буферная система 1 по Мауреру?



    Настасья /27.03.2010 15:15/
    Здравствуйте!У меня проблема - делаю электродный буфер 10x, по схеме на литр 30,3 трис-основание, 144 г глицин, 10 г СДС,компоненты беру в расчете на 250 мл.рН получается в районе 8.9, 2 раз переделывала. Что не так?:-(Помогите!



    bukach /30.03.2010 01:02/
    (Настасья @ 27.03.2010 16:15)
    Ссылка на исходное сообщение  Здравствуйте!У меня проблема - делаю электродный буфер 10x, по схеме на литр 30,3 трис-основание, 144 г глицин, 10 г СДС,компоненты беру в расчете на 250 мл.рН получается в районе 8.9, 2 раз переделывала. Что не так?:-(Помогите!

    все нормально. не нервничайте, так и должно быть. спокойно разводите и ставьте форез. попробуйте у однократного перемерить рН )
    а ещё можно почитать про солевую ошибку и коэффициент активности и что с ними происходит при высоких концентрациях



    Sheli /28.04.2010 15:52/
    подскажите пожалуиста где можно посмотреть протокол нативного фореза для белка с щелочной изоточкой (8.5), нашла при кислом рН но хотелось бы что-то около 6.0, ближе к физиологическим условиям.Спасибо



    guest: ммм /28.04.2010 16:20/
    - бы что-то около 6.0

    Сильно размоется зона при таком подходе.
    Если вас это устраивает гоните в борнокислотном растворе 50-100мМ, с соответствующим рН.



    Sheli /28.04.2010 23:22/
    спасибо за ответ.
    Задача посмотреть образуется ли димер; если все размоется наверное это не совсем хорошо, могу полосу димера не увидеть, а хочется.При кислом рН скажем 5.0 не должно быть размывания?



    guest: ммм /29.04.2010 10:54/
    --При кислом рН скажем 5.0 не должно быть размывания?

    Нет размывания не должно быть при ступенчатой буферной системе - она кислая.

    -Задача посмотреть образуется ли димер; если все размоется наверное это не совсем хорошо, могу полосу димера не увидеть

    Чем больше масса мономера тем легче увидеть димер. Увидеть вполне реально и на непрерывной буферной системе.



    Sheli /29.04.2010 16:35/
    ценно, спасибо,
    мономерчик 24 кДа, не очень-то большой



    guest: ммм /29.04.2010 17:36/
    24кда и 48 кда это вполне разница в 12.5% геле должны хорошо разбегаться



    Microbius /05.05.2010 13:14/
    Уважаемые форумчане!

    Подскажите, возможно ли возобновить активность старого, очень старого TEMED путём перегонки для дальнейшего его использования.

    Благодарю. :-)



    guest: ммм /05.05.2010 13:46/
    -очень старого TEMED путём перегонки
    А вы попропобуйте, скорее да чем нет.



    Beonick /24.06.2010 00:43/
    Всегда делал форез на вестерн без проблем, а тут столкнулся с какой то ерундой. confused.gif Маркер ladder Fermentas разделяется идеально, а сами образцы вообще не разделяются и все кроме маркера выглядит как размазня с разводами и несколькими зубчатыми фронтами, причем эти фронты заметно еще до окраски при самом форезе. Они полупрозрачные но различимые, неокрашенные но их видно за счет другого преломления света, как границу между заполимеризировавшимся гелем и дистилятом. Что это может быть? Все буферы стандартные, мочевину не использую, при приготовлении проб использую только ингибитор протеаз с которым никогда никаких проблем не возникало и Loading buffer с 0,1% БФС, 2% СДС, 100мМ ДТТ, 50 мМ Трис рН6,8, 10% глицерин. Я так понимаю если маркер нормально разделяется значит проблемы с самими пробами или Loading buffer? Или маркер может нормально разделятся а пробы нет при проблемах с буферами или АА?



    guest: ммм /24.06.2010 12:08/
    --Что это может быть?
    Соли это могут быть - фосфаты, сульфаты, бораты очень много тритона в пробе и посторонние полимеры заряженные - РНК, гепарин, альгинаты, полиакриловая кислота.

    Для начала пробу разбавьте в 3-5 раз и посмотрите, что будет дальше.



    Beonick /24.06.2010 16:43/
    --Соли это могут быть - фосфаты, сульфаты, бораты очень много тритона в пробе и посторонние полимеры заряженные - РНК, гепарин, альгинаты, полиакриловая кислота.

    хм... Подозреваю что это все таки гепарин. Так как разгонял пробы эритроцитов и сыворотки, а туда наверняка давали гепарин когда брали кровь. Попробую разбавить. Как с этим еще можно бороться? Странно, раньше разгонял сыворотку, и сам же когда брал кровь добавлял гепарин - все было найс. Наверное в эти пробы хорошо гепарина ухнули. Но почему тогда белки нормально не разделились, гепарин наверное должен просто давать левый фон и разводы?



    Beonick /24.06.2010 16:47/
    Кстати, кто разгонял кровь - плазму или эритроцитарную фракцию , поделитесь как Вы пробы готовили и сколько наносили чтобы не было перегруза



    Dada /08.09.2010 23:58/
    Скажите, пожалуйста возможные причины "провисания" картинки фореза-т.е. белки в средних лунках идут ниже.

    Еще один вопрос, при проявке блотов полоски белков бывают очень четкие, а в следующий раз (при тех же условиях) они размыты. кажется проблема не в переносе и в антителах, а именно в форезе.В чем? Спасибо заранее за ответы



    MrDmitry /09.09.2010 00:56/
    В общем случае причины неровностей - неровное поле. Причин может быть много - гель неравномерно заполимеризовался (в центре плохо), наоборот сел сильно и по краям между спейсером и гелем образовались зазоры (тогда спейсер нужно подвинуть), просто плохая камера с плохими кривыми электродами и плохим охлаждением. Хорошая импортная камера с полной погрузкой в буфер при аккуратной работе и качественной заливке геля всегда даёт отличную ровную картинку. wink.gif

    Стандартизация всегда даёт полную воспроизводимость результатов - относится ко всему - все реактивы, время, ток, температура (и реагентов) даже количество пипетирований при заливке геля, количество образца и буфер для него - всё-всё. Оцените сами чем отличается каждое ваше действие в протоколе в плохом и хорошем случае и Вы найдёте ответ smile.gif



    guest: ммм /09.09.2010 09:54/
    -Скажите, пожалуйста возможные причины "провисания" картинки фореза-т.е. белки в средних лунках идут ниже.

    В 90% случаев это результат плохого прилегания боковушек к гелю, как следствие паразитный шунт, по которому течет ток и снижает разность потенциалов в этой области.

    --Еще один вопрос, при проявке блотов полоски белков бывают очень четкие, а в следующий раз (при тех же условиях) они размыты.

    Чаще всего 2 причины:
    1) Гель перед переносом долго лежал(или лежал при более высокой температуре) прежде чем по нему пустили ток в перпендикулярном направлении.
    2) Убежал фронт из геля и после этого гнали форез дольше чем обычно.



    Nicolai /10.09.2010 11:35/
    подскажите есть ли кто на форуме кто занимается анализом гибридности семян (кукурузы, подсолнечника, ячменя ....).



    guest: plotter /01.10.2010 18:05/
    Microbius, вам виальчик темеда почтой переслать? Такие реактивы скупиться это уж вообще...

    Beonick, я плазму гонял (скорее от любопытства и наличия свободных треков). Без сильного перегруза получалось если брать примерно 1/5 мкл плазмы на трек. Но красить серебром, т.к. с моим коллоидом (~1.5ng чувствительность) кроме альбумина и глобулинов было мало что видно.

    Господа, кто делал 2-D "на коленке", поделитесь секретами. Очень хочется это сделать, но ради праздного любопытства брать камеру за 2k$ как-то... Вот если что интересного найду, тогда уж можно.



    guest: ммм /01.10.2010 18:24/
    трубки из кубовых стеклянных пипеток втыкать в камеру(два тазика) на резиновых кольцах от шланга(просверлить дырки в одном из тазиков), куда не втыкать туды рез.пробку. Электроды платиновые, напруг нужен большой под 1000V.








       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler