Главная страница MolBiol.ru > Методы > Белки > Окрашивание гелей Кумасси R250 Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Окрашивание белковых гелей Coomassie brilliant blue R250

Метод наименее чувствительный (по сравнению с серебряным окрашиванием или окрашиванием Zn/имидазолом). Его делают популярным два сравнительных преимущества: (i) он проще и несравненно дешевле, чем серебряное окрашивание; (ii) в отличие от окрашивания Zn/имидазолом, гель можно высушить и сохранить.
  1. поместить гель в ~ 5V Staining solution на ~ 4h (лучше с покачиванием);
  2. убрать Staining solution (его можно использовать несколько раз);
  3. быстро сполоснуть гель H2O;
  4. отмывать в двух сменах Destaining solution:
  5. Destaining solution I ~ 20'-2h (в зависимости от температуры),
    Destaining solution II ~20'-2h;


    альтернативный метод отмывки (Дмитрий Жарков)
    4.   гель кладется в широкую стеклянную посудинку с холодной водой (200-300 ml), и кипятится ~5' (или до желаемой прозрачности);

    ещё один вариант (Gottfried Willharm)
    4.   при отмывке (не важно, в Destaining solution или при кипячении в воде) накидать в сосуд для отмывки мелко рваной бумаги (фильтровалки или туалетной). Чистой, разумеется. При этом за счйет сорбции R-250 на бумаге уменьшается фон и скорость отмывки значительно возрастает. Фактически, это удобный аналог двухфазного раствора.

  6. гель либо фотографировать, либо сушить.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 23961

    Растворы

    Staining solution

    (хранить при NT в плотно закрытой посуде):

    Конц.Сток100ml
    Coomassie Blue R2500.25тв.0.25g
    Метанол45%100%45ml
    H2O45%mQ45ml
    Уксусная к-та10%ледяная10ml
  • Растворять краситель на бактериальном шейкере, затем фильтровать через бумажный фильтр.
  • Destaining solution

    (хранить при NT в плотно закрытой посуде):
    двухфазная система, состоящая на 10-20% из бутанола и на 90-80% из:

    Конц.Сток100ml
    Уксусная к-та5%ледяная5ml
    H2O95%mQ95ml


    Комментарии

    Общие

  • Чувствительность: 0.1-1.0µg белка на бэнд.
  • Метод не очень чувствителен, и вполне возможно работать с гелем без перчаток. Но мы не советуем этого делать, если Вам не хочется, чтобы в транспорте косились на Ваши синие пальцы.
  • Непроверенная информация При окрашивании фон возникает из-за SDS и буфера, если их предварительно отмыть фон получится существенно слабее:
  • * отмыть гель в 2х сменах большого объёма 5mM HCl (каждая смена ~1h);
    * далее - окраска как обычно.

    По пунктам

    п. 1.

  • Скорость окрашивания зависит от температуры. При 60-65oС достаточно <1h. Внимание (!!!) горячее окрашивание можно проводить только под тягой: пары метанола сильно ядовиты.
  • п. 4.

  • Отмывка идет существенно быстрее при повышенной температуре. Но(!) при этом за ней нужно следить, иначе можно смыть не только фон, но и специфический сигнал (если всё же не уследили, окрашивание можно повторить). Внимание (!!!) горячую отмывку можно проводить только под тягой: пары метанола сильно ядовиты.
  • Бутанол вытягивает краситель из водной фазы. Двухфазный Destaining solution гораздо удобнее, чем однофазный или двухфазный с поглотителями. Отмывка существенно быстрее, раствор служит гораздо дольше.
  • Destaining solutions I и II различаются только названиями. Destaining solution I применяется первым (предварительная отмывка), он более грязный. Destaining solution II (финальная отмывка) - чище. Когда бутанол в Destaining solution I становится совсем грязным, его выбрасывают (удобнее отсосать вакуумным насосом); на его место переливают бутанол из Destaining solution II, который, в свою очередь, заменяют свежим бутанолом (или просто переобозначают раствор "II" в "I").
  • п. 5.

  • Удобство в том, что без уксусной, без метанола, и гораздо быстрее. Результат - как при стандартной отмывке, может, фон чуть погуще. Растрескивание при сушке обычное. Мы так отмываем уже года два, оригинальная ссылка на: G.Hervieu. A quick and safe method for destaining Coomassie-Blue-stained protein gels. Technical Tips Online.
  • п. 6.

  • Обычно гель сушат (т.к., если человек умеет фотографировать, то лучше пользоваться Zn/имдазол методом: он существенно быстрее и чувствительнее).
  • Есть два пути решения проблемы растрескивания гелей при сушке (обычно это касается только высокопроцентных гелей):
    1. инкубировать гель перед сушкой или ~1h в 20% глицерине, или ~30' в ацетоне.
    2. использовать более мощный вакуумный насос.


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


    Дополнения, комментарии, вопросы

    _Павел Егоров_ /11.01.2006 02:06/
    Перед окрашиванием гель прокипятить 3 мин. в дистиллированной воде, в микроволновке. Так можно быстро удалить значительное количество SDS из геля, что позволит уменьшить фон и сократить время окрашиывния.



    _arwerha_ /11.01.2006 03:39/
    БЫСТРЫЙ СПОСОБ ОКРАСКИ!

    Главное его преимущество - то, что через час Вы уже сможете узнать о том, что Ваш белок опять не там (или там, если повезло)
    Ну, и реактивы без всякого особо ядовитого метанола. Спирт, уксус...

    Краситель: 0,22% (масс/об) Кумасси G-250, 40% (об/об) этанол, 8% (об/об) уксусная кислота.

    Гель залить красителем, нагреть до появления пара (на горелке или в микроволновке - у кого что есть) , под крышкой оставить минут на 15, после чего краситель слить обратно в колбу (он работает долго без замены). Гель отмывать от фона кипячением в нескольких сменах воды (из-под крана или дистиллята, это не очень принципиально) до исчезновения окраски фона и проявления полос белка.



    Alder /11.01.2006 20:25/
    спасибо!
    только это к другой страничке, где окраска с использованием G-250



    _Valery Tarasov_ /11.01.2006 22:37/
    Можно все это проделать быстрее и безопаснее

    1. 10-15 минут в 10% Укс.к., 40% этанол - фиксация
    2. 20 мин. в 0.4% Coomassie Blue R250, 10% Укс.к., 40% этанол - окрашивание
    3. 20 мин. в 10% Укс.к. - отмывка (если белка много то и после первых минут видны полосы)



    Olori /07.09.2006 21:19/
    Вот спасибо!



    bkrg /26.10.2006 15:35/
    С Кумасси R-250 мы красим так.
    За 10 мин. до окончания фореза ставится кастрюлька с водой на плитку. К моменту окончания фореза она закипает. Гель кидается в стакан, заливается раствором следующего состава: этанол - 300мл, вода - 300мл, ледяная уксусная к-та - 60мл, кумасси R250 - 0,7г. Наливать не очень много, но так, чтобы гель свободно болтался в жидкости. Кипятим стакан на водяной бане - 10мин. Краску сливаем (ее можно использовать многократно), ополаскиваем гель в стакане водой, заливаем 7%уксусом (столько же, сколько и краски) и кипятим 3-5 мин. Меняем уксус, снова кипятим. После 3й смены гель гарантированно отмывается. Все делать под тягой. Кипятить с краской обязательно на водяной бане, иначе она будет плеваться во все стороны



    curious67 /26.10.2006 15:46/
    микроволновка, безусловно, много лучше, если налит немного, то пару минут- и уже все почти кипит, только следить, чтоб гель не скукожился, и будет хорошо

    А что, помыть в горячей воде (те использую слово кипяток, ибо риск) перед окрашиванием снижает фон?



    Гость /07.11.2007 01:11/
    Кто нибудь знает как сделать коричневый раствор кумаси (как в "Bio-Rad Bio Safe Commassie")?

    Красится и отмывается без кипячения за 20 мин.

    у меня была ссылка на протокал в статье 70х или 80х годов.



    Guest /07.11.2007 01:17/
    colloidal coomassie - в гугле



    Guest /07.11.2007 22:25/
    Несколько "заметок на полях" smile.gif
    С G-250 - коллоидный раство получают, постепенно примешивая раствор красителя к 10% ТХУ, получается эдакая смесь цвета хаки. Фон, действительно, слабее, но и чувствительность ниже - потому что окрашиваются белки только на поверхности геля, а не по всей толще, т.к. колллоидный раствор плохо проникает.

    Если готовить раствор красителя не с этанолом, а изопропанолом, то SDS диссоциирует быстрее и фиксация происходит лучше. К тому же лучше, чем при стандартной процедуре, окрашиваются гликопротеиды.

    А для хорошей отмывки, не распространяя вокруг себя аппетитные пары уксуса с этанолом smile.gif удобно погрузить белок в отмывочный раство с 10% глицерином - гель сжимается и белеет, при возвращении в нормальную среду восстанавливается в размерах, но фон гораздо ниже (личное наблюдение ).
    Убирать краску можно легко, добавляя в отмывочный раствор куски поролона - замечательно экстрагирует кумасси.



    Гость /16.01.2009 14:21/
    ОЧЕНЬ БЫСТРЫЙ МЕТОД ОКРАШИВАНИЯ (10-15 МИНУТ!!!)

    Граждане, все можно сделать еще проще и быстрее. При окрашивании геля Кумасси R-250 довести раствор краски с положенным в него гелем до кипения в микроволновке (это буквально одна минута) и все. Никакая фиксация не нужна, белки фиксируются уже в краске.

    Дальше можете уже отмывать в воде при кипении. Налейте в пластиковую коробочку для микроволновки воду (побольше) и доведите до кипения (минуты 3). Кипятить не надо, можно отмыть нужную полосу. Набросайте фильтровальную бумагу (любую, которую не жалко, хоть туалетную) и покачивайте, пока синий фон из геля не перейдет в бумагу. Затем воду смените и процедуру повторите. Все! Окрашивание закончено! На все-про-все - 10-15 минут!

    Если хотите удалить из геля SDS (чтобы раствор краски после использования можно было хранить и использовать бесконечно долго), вместо обычной процедуры фиксации, наверное, можно попробовать кипятить гель в воде до окрашивания, как предлагалось выше. Никогда не пробовала, однако, метод кажется вполне разумным.



    metrim /25.01.2016 12:21/
    Можно ли в рецептуре метанол заменить этанолом?



    R.J.Dio /25.01.2016 12:55/
    так и надо, жить спокойнее и проще, результат тот же



    metrim /26.01.2016 01:45/
    Ну просто в хроматографии и методах мокрой химии этанол и метанол - далеко не одно и то же, так что не хотелось бы на собственной шкуре шишки набивать
    НУ раз "все юзают этанол", а ето в отличии от метанола у меня практически неограничено, бум его лить



    R.J.Dio /26.01.2016 12:18/
    лить и пить!








       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler