Главная страница MolBiol.ru > Методы > Белки > Окрашивание белка на 3MM Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Определение концентрации белка на 3ММ

Наиболее удобный метод, когда речь идет об оценке концентрации белка в большом количестве образцов (например, фракции с колонки).
    Нанесение образцов на 3MM
  1. на 3MM бумагу нанести ряд 2х разведений BSA (по ~1µl);
  2. нанести образец:
  3. качественная оценка в ряде образцов:

    нанести ряд образцов (по ~1µl);

    количественное измерение:

    нанести 2х разведения измеряемого белка (по 1µl);

  4. cушить (либо "Ветерок" ~5', либо 65oС ~10');
  5. смочить в ацетоне, высушить;
  6. красить ~5' в Staining Solution;
  7. отмывать в Dest. solution (~5-15');
  8. степень отмывки контролировать визуально;
  9. сполоснуть водой;
  10. высушить, вклеить в журнал.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 13084

    Растворы

    Staining solution

    (хранить при NT в плотно закрытой посуде):

    Конц.Сток100ml
    Coomassie Blue R2500.25тв.0.25g
    Метанол45%100%45ml
    H2O45%mQ45ml
    Уксусная к-та10%ледяная10ml
  • Растворять краситель на бактериальном шейкере, затем фильтровать через бумажный фильтр.
  • Destaining solution

    (хранить при NT в плотно закрытой посуде):
    двухфазна система, состоящая на 10-20% из бутанола и на 90-80% из:

    Конц.Сток100ml
    Уксусная к-та5%ледяная5ml
    H2O95%mQ95ml


    Комментарии

    Общие

  • Наиболее удобный метод, когда речь идет об оценке концентрации белка в большом количестве образцов (например, фракции с колонки). Окраска 2µl пятнышек детектируется и заметно изменяется в диапазоне 10ng - 10µg (для BSA).
  • Основной недостаток метода - сравнительно низкая точность оценки количества белка.
  • Достоинства - быстро, просто, дёшево, позволяет анализировать одновременно десятки образцов. Очень слабо чувствителен к раствору, в котором находится белок. => Этот метод - альтернатива точных методов, когда речь идет об измерении концентрации белка, растворенного в неудобном буфере.
  • Дополнительно, смотри замечания к "Окрашивание белковых гелей Coomassie brilliant blue R250."

    По пунктам

    п. 1.

  • Растворы белков часто набираются в тип более или менее точно только в первый раз. Потом - какие-то фокусы с поверхностным натяжением приводят к тому, что в тип затягивается большее количество раствора. => надо обязательно контролировать объем визуально.
  • Контрольная полоса совершенно необходима в случае количественных измерений. Лучше, когда она присутствует и в качественных.
  • п. 2

  • Разведения обязательны, т.к. при одиночном нанесении ошибка может быть очень высока, особенно, если угодить в диапазон слишком высоких (насыщающих) концентраций.
  • п. 3, 4.

  • Фиксация белка на бумаге.

    Дополнения, комментарии, вопросы

    Гость /29.03.2006 11:23/
    Здравствуйте. Можно узнать поподробнее, что-такое ЗММ бумага? Заинтересовался методом потому, что до этого определял белок по Брэдфорду - попотеть пришлось. Образцов обычно много, вот и думаю, что может на этот метод перейти. Тем более что слишком точная концентрация мне не нужна.



    Павел /29.03.2006 11:37/
    ватман такой.



    Гость /29.03.2006 11:52/
    Просто ватман, или какой-то специальный, который предназначен именно для этих целей? И если не трудно, можно ли узнать поподробнее про способ нанесения образцов на этот самый ватман.



    Re /29.03.2006 14:11/
    Плотная фильтровальная бумага. Наносить каплей из носика автоматической пипетки.
    Удобнее - держать на столе на белом фоне иммунологическую плашку с раскапанным раствором по Брэдфорду и капать с колонки аликвот в ячейку. Чем больше белка, тем синее. Соотношение объемов краска/белок подбирается эмпирически.



    ммм /29.03.2006 15:55/
    На самом деле любая фильтровашка, промокашка, салфетка и даже подтирка. Лишь бы воду впытывала номально.

    ---Удобнее - держать на столе на белом фоне иммунологическую плашку с раскапанным раствором по Брэдфорду и капать с колонки аликвот в ячейку

    Удобнее, но промокашка незаменима, если в растворе с белком содержатся вещества мешающие определению по Брэдфород, например меркаптоэтанол.



    Гость /10.04.2006 08:07/
    Скажите, а не кто не пробовал определить концентрацию белка в спектрофотометре прогнав там эту самую иммунологическую плашку? Ведь, в принципе, можно же установив длину волны 595, раскапать белковый преперат, покрасить Кумасси и прогнать? Просто, как вспомню как я этот белок определял (20-25 образцов, да несколько повторов).



    Гость /10.04.2006 08:12/
    Кстати, а ведь, наверное, можно подобным образом и концентрацию хлорофилла определять? Но это при условии, что в лаборатории есть АИФ. Кто что по этому поводу думает?



    Гость /10.04.2006 10:26/
    Пардон, народ, за наивные предположения. Во всем разобрался. К сожалению, на нашем АИФе невозможно промерить белок и хлорофилл потому, что измерения при длинах волн 595, 665 и 649 не предусмотрены. Жаль.



    ммм /10.04.2006 12:12/
    Ну вы блин даете все так делают. В плашках. Ну и что.



    Arc /12.04.2006 12:29/
    а еще проще- накапать белок на нитроцеллюлозу и покразить Amido Black, естественно, с калиброванным контролем типа BSA. +/- 1,5 раза концентрацию даст точно- с той же погрешностью, что и Кумасси по Брэдфоорд, ибо принцип окрашивания тот же



    Гость /30.11.2006 15:54/
    Метода Брэдфорд - ацтой! BCA rulez!



    ASolov /01.12.2006 11:37/
    (Гость @ 30.11.2006 12:54)
    Ссылка на исходное сообщение  Метода Брэдфорд - ацтой! BCA rulez!


    LOL lol.gif



    Guest /24.11.2009 13:03/
    здравствуйте! подскажите, пожалуйста хочу покрасить мембрану после переноса, проверить как перенеслись белки с геля(12,5% PAAG). есть кумасси раствор,которым крашу гель, технология такая же? отмывать потом мембрану также 10% уксусной?



    Andrew /24.11.2009 13:31/
    Окрашивать нужно пунцовым С, как описано здесь: http://molbiol.ru/protocol/17_08.html ( http://molbiol.ru/protocol/17_08.html )



    Вера /24.11.2009 13:54/
    (Гость @ 29.03.2006 09:52)
    Ссылка на исходное сообщение  Просто ватман, или какой-то специальный, который предназначен именно для этих целей? И если не трудно, можно ли узнать поподробнее про способ нанесения образцов на этот самый ватман.



    Бумага любая, лишь бы впитывала и не расползалась при отмывке (фильтровалка не очень годится).
    Носиком в предварительно обозначенные карандашом точки- 2-3 мкл из соответствующей пробирки. Хорошо высушить (обязательно!)

    Окунуть на несколько секунд в стардартный раствор Кумасси R250 для окрашивания белковых ПААГ.
    Промывать под сильной струей ХОЛОДНОЙ воды до исчезновения синего фона. Остаются синие пятна соответствующей интенсивности на голубоватом фоне.

    (После просущивания становится видно хуже, лучше смотреть мокрую после отмывки).








       


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler