составить экспериментальные смеси, лучше - несколько разведений:
200µl (Protein determination mix) + (образец в V=10µl);
инкубировать
* по методике кита 37oC, 30' (можно NT, ON),
* по "Guide to protein purification" 60oC, 30'. Написано, что это повышает чувствительность и уменьшает белок-белковые различия;
охладить до NT;
измерять OD562(от низких концентраций к высоким, тогда не придется мыть ячейку);
по значениям "a"-"e" построить калибровочную таблицу, рассчитать концентрации в экспериментальных образцах.
Допустимые для BCA prot. assay концентрации примесей (на 10µl).
Кислоты и основания
HCl
0.1M
NaOH
0.1M
PCA
<1%
TCA
<1%
Буфера
Acetate
0.2M
(NH4)2SO4
20%
Borate
10mM
Citrate
<1mM
Glycine
1M
HEPES
100µM
Phosphate
250mM
Tris
0.1M
Детергенты
Brij 35
1%
CHAPS
1%
Lubrol PX
1%
Octyl-glucoside
1%
SDS
1%
TritonX-100
1%
Tween-20
1%
Восстановители
DTT
<1mM
bMeEtOH
<1%
Miscellaneous
DNA/RNA
20µg
DMSO
5%
EDTA
10mM
Glycerol
10%
KCl
<10mM
NaCl
1M
Sucrose
40%
Urea
3M
Кит можно использовать для определения не только белковой, но и солевой фракции, сходящей с колонки. Для этого образец вносят на колонку с 1mM ascorbat Na (который идёт вместе с солью). В этом случае asсorbate "проявляется" сразу же после добавления "Protein determination mix", а белки - только после прогрева.
По пунктам
п. 4.
При желании время "проявления" можно значительно сократить: пробирки поместить в водяную ванночку и обработать ~20'' в микроволновой печи на полной мощности.
Дополнения, комментарии, вопросы
Profi/13.10.2005 06:31/
Для стандартной микрокюветы на 700 мкл я использую следующие соотношения растворов (пересчитаны из стандартного кита Сигмы): 600 мкл раствора бицинхониновой кислоты смешивают с 30 мкл 4%-ного медного купороса (5-водного сульфата меди) и с 30 мкл раствора белка с концентрацией 0,1-1,0 мг/мл. Инкубация 30 мин при 37 градусах. Я вбил калибровку на Биорадовский SmartSpec 3000 2 года назад и пользуюсь методом. Проверка показала, что калибровка работает (реактивы не протухли, спектрофотометр не умирает).
Николай Полянский/27.05.2008 11:10/
Уважаемые коллеги, не подскажет ли кто, в чем тут может быть дело? Я использовал вот такой метод: Reagents 1. Reagent A: 8 gm sodium carbonate monohydrate, 1.6 gm sodium tartrate, brought to 100 ml with distilled water. Adjust the pH to 11.25 with 10 M NaOH. 2. Reagent B: 4 gm BCA in 100 ml distilled water. 3. Reagent C: 0.4 gm cupric sulfate (5 x hydrated) in 10 ml water. 4. Working solution: Mix 1 volume reagent C with 25 volumes reagent B, then add 26 volumes reagent A to the C/B mixture. Assay 1. Prepare samples containing 0.2 to 50 micrograms protein in 500 microliters. 2. Add 500 microliters working solution to each 500 microliters sample and mix. Incubate 60 min. at 60 degrees C. 3. Cool the samples and read at 562 nm. Analysis Prepare a standard curve of absorbance versus micrograms protein (or vice versa), and determine amounts from the curve. Determine concentrations of original samples from the amount protein, volume/sample, and dilution factor, if any. If you are unfamiliar with how to obtain a protein concentration for a diluted sample from a standard curve, see how to prepare and use a protein standard curve. Reference Stoscheck, CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69 (1990).
С альфа-кристаллином калибровка в интервале 0,5 - 20 мкг в пробе давала нормальную линейную зависимость, а когда я пытался постооить с БСА "Sigma", то получалось сплошное безобразие. Николай Полянский
Гость/16.01.2009 14:34/
А какой концентрации должен быть раствор бицинхониновой кислоты и какой чистоты должен быть этот реактив? Подскажите, пожалуйста.
MolBiol.ru >
Методы >
Белки > Определение концентрации белка
Zbio-wiki
Дополнить
Кит можно использовать для определения не только белковой, но и солевой фракции, сходящей с колонки. Для этого образец вносят на колонку с 1mM ascorbat Na (который идёт вместе с солью). В этом случае asсorbate "проявляется" сразу же после добавления "Protein determination mix", а белки - только после прогрева.