Главная страница MolBiol.ru > Методы > Белки > Western Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Western blotting

Георгиева София,
Институт Молекулярной Биологии

Все в перчатках! (Можно reusable).

    Сухой перенос на трансблоттере

  1. отрезать концентрирующий гель, ненужные участки геля, правый верхний угол;
  2. качать гель в TS 10' при NT;
  3. приготовить мембрану (на 4-6mm шире и длиннее геля) и 6 таких же кусков Whatman 3MM (если у геля обрезан угол, у мембраны и ватмана обрезать тоже);
  4. мембрану смочить 5' в H2O, затем 5' в TS (PVDF мембрану прежде всего смочить в метаноле 15'');
  5. ватман смочить в TS;
  6. приготовить сэндвич показанный на рисунке (аккуратно прокатывать пипеткой, чтобы выгнать пузыри):


  7. Электроперенос сухой

  8. перенос 25', выставив ограничение по току Amax=2mA/cm2(например, для геля размером 10х10cm2xAmax=200mA).
  9. после переноса

  10. снять крышку, верхние куски Whatman, отметить на фильтре сторону, на которую шел перенос (сторона P);
  11. сполоснуть фильтр в 1хPBS, хранить:
  12. * ON при NT (сухим, завернутым в фильтровалку);
    * по крайней мере 2 недели при +4oC (влажным, завёрнутым в SaranWrap или в ванночке с PBS);

  13. пластины прибора после переноса промокнуть фильтровалкой, сполоснуть дистиллированной водой из промывалки, вытереть полотенцем. Дать высохнуть, закрыть;


  14. Окрашивание белков на фильтре

  15. после переноса белки на мембране можно окрасить (лишь окрашивание Ponceau S обратимо и полностью совместимо с со всеми методами иммуноокрашивания);


  16. Характеристики белковых красителей

    Способ
    окраски
    *NCNP Окрашивание
    Ponceau S 1-2µg + - + обратимое
    Amido Black 1.5µg + - + постоянное, низкий фон
    Comassie blue 1.5µg + - + постоянное, высокий фон
    India ink 100ng + - + постоянное
    Biotin-avidin 30ng + + + постоянное, бледнеет со временем
    Colloidal gold 3ng + - + постоянное

    * - Чувствительность
    NC - Нитроцеллюлоза
    N - Нейлон
    P - PVDF

  17. если мембрана была высушена - аккуратно положить её на поверхность H2O, дать промокнуть под действием капиллярных сил и утопить на 3-5';
  18. перенести в окрашивающий раствор PSS, 5-10' с покачиванием;
  19. после появления картинки сполоснуть мембрану в нескольких сменах H2O;
  20. положение маркера отметить водоустойчивыми чернилами/карандашом.


  21. Гибридизация

  22. забивка в HB на качалке 40' NT (или +4oС ON);
  23. гибридизация с "I"а/т в HB в гибридайзере 2h 26oC (или +4oС ON);
  24. заморозить раствор для I-гибридизации;
  25. отмывка 3х 5' в WB на качалке NT;
  26. гибридизация со "II"а/т в HB в гибридайзере 30-50' 26oC;
  27. заморозить раствор для II-гибридизации;
  28. отмывка, как в п.19.


  29. Проявление Westerna (ECL-kit)

  30. мембрану вынуть из отмывочного раствора, промокнуть на фильтровалке, положить на Saran Wrap (сторона Р - вверх);
  31. смешать равные объёмы растворов 1 и 2 (приблизительно по 0.5-1.0ml, в зависимости от размера фильтра), нанести на фильтр (можно пульверизатором);
  32. 1' NT (следить, чтобы был покрыт весь фильтр);
  33. если раствора много, приподнять фильтр, дать лишней жидкости стечь с угла;
  34. а) Если свежие ECL реагенты и хорошие а/т:
  35. * подготовить заранее пленку, кассету, фиксаж и проявитель;
    * мембрану положить на стекло, стороной Р вверх, сверху покрыть Saran Wrap, отнести в темную комнату, положить на стол.;
    * рентгеновскую плёнку наложить сверху, прижать; сделать несколько экспозиций: 5'', 30'', 60''; проявить; оценить автограф, если слишком сильный или слабый, повторить экспозицию, но уже с откорректированным временем.

    б) Если ECL реагенты старые и/или плохие а/т:

    в этом случае требуется большое время экспозиции, поэтому:

    * фильтр завернуть в Saran Wrap, заложить на экспозицию в кассете на 3';
    * перезаложить (на вторую плёнку);
    * первую пленку проявить, по ней оценить, сколько времени нужно экспонировать вторую (но >30' бессмысленно).


    Хранение фильтра после проявления

  36. Хранить влажными (в 1хPBS):
  37. (1) +4oС на стекле, покрытым Saran Wrap, до 2-3 недель;
    (2) +4oС в растворе 1х PBS, до 1-2 недель - пока не прорастёт;
    (3) Непроверенная информация +4oС в растворе 1х PBS + 0.005%NaN3, >4 месяцев;
    (4) долговременное хранение: завернуть в Saran Wrap, запаять в полиэтиленовый пакет, (optional - проложить между стёклами), хранить на -70oС.



    Отшпаривание от а/т для повторной гибридизации

    Не всегда нужно, т.к. обычно и без него можно разобраться.
    (и для NC, и для PVDF):

  38. 30' 50oС в SB;
  39. сполоснуть фильтр 1хPBS.



  40. Хранение а/т

    На этот счет существуют разные мнения:

    1. Некоторые замораживают в жидком азоте небольшие аликвотами, хранят на -70oС, размораживают 1 раз и далее хранят при +4oС. По нашему опыту на +4oС лучше не хранить более месяца.
    2. Другие хранят на -20oС, размораживают и замораживают при каждом использовании.
    3. На некоторые фирменных а/т есть указания как с ними обращаться. Но в любом случае слишком большие фасовки лучше разаликвотить и часть заморозить.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 49776



Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


    Растворы

    PBS

    pH(1x)=7.4, (хранить при NT или при 4oС):

    1x10xСток100ml500ml
    KH2PO41.7mM17mM136.1g/M0.231g1.157g
    Na2HPO45.2mM52mM142g/M0.738g3.692g
    NaCl150mM1.5M58.44g/M8.77g43.83g
    H2O mQ    
    1x10xСток100ml500ml
    KH2PO41.7mM17mM136.1g/M0.231g1.157g
    Na2HPO4x7H2O5.2mM52mM268.1g/M1.394g6.971g
    NaCl150mM1.5M58.44g/M8.77g43.83g
    H2O mQ    
  • стерилизовать автоклавированием;
  • pH зависит от концентрации, поэтому измерять лишь разбавив до 1х.
  • Непроверенная информация pH 10x должен быть ~6.8 (если необходимо, можно довести NaOH). Стерилизовать автоклавированием. После разбавления pH должен стать 7.4.
  • TS

    Transfer solution, Буфер для переноса /для NC (хранить при NT):

    Конц.Сток1 l
    Tris-base47.9mM121.1g/M5.8g
    Glycine38.6mM75.05g/M2.9g
    SDS (10%)0.0385%10%3.85ml
    Метанол20%100%200ml
    H2O mQ  
  • Для PVDF: нужно исключить SDS и уменьшить содержание метанола до 100ml/L, остальное так же.
  • PSS

    10х Ponceau S staining solution (хранить при NT, разводить перед применением):

    Конц.Сток5ml100ml
    Ponceau S2%тв.0.1g2g
    trichloroacetic acid30%тв.1.5g30g
    sulfosalicylic acid30%тв.1.5g30g
    H2O mQ   

    WB

    Washing buffer, Раствор для отмывки (готовить перед использованием):

    Конц.Сток100ml
    сухое молоко5%тв.5g
    PBS10х10ml
    Tween-200.1%10%1.0ml
    H2O mQ  

    HB

    Hybridization buffer, Раствор для гибридизации и забивки неспецифической сорбции:

    Конц.Сток100ml
    сухое молоко5%тв.5g
    PBS10х10ml
    H2O mQ  
  • Хранение раствора после гибридизации:
  • если а/т сильные, раствор можно использовать еще несколько раз. Для этого после гибридизации собрать раствор и хранить при -20oC (>месяца).

    SB

    Stripping buffer, Буфер для отшпаривания (готовить перед использованием):

    Конц.Сток10ml
    Tris Cl pH6.850mM1M0.5ml
    SDS2%10%2.0ml
    b-MeEtOH100mM14.5M69 µl
    H2O mQ7.43ml


    Рецепты ECL-растворов

    (очень ценное дополнение от Алексея Терентьева (alexei@icp.ac.ru)).

    Раствор А

    68 mM p-Coumaric acid in DMSO (0.089g на 8ml)

    Раствор B

    1.25 mM Luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phtalazidenion) в 0.1 M Tris-HCl pH 8.5

    Применение

    140µl Раствора А + 14ml Раствора В + 5µl 30% H2O2, инкубировать блот 1', - и на пленочку. Я пробовал. Шикарно работает.

    Комментарии

    Общие

  • Все способы постановки Western состоят из следующих этапов:
  • 1) перенос белка из геля на мембрану;
    2) забивка неспецифической сорбции;
    3) адсорбция I-антител;
    4) отмывка;
    5) адсорбция II -антител;
    6) отмывка;
    7) проявление фильтра;

  • Какой тип мембраны использовать: NC или PVDV (говорят, последняя чувствительнее) зависит только от вашего вкуса. NC мембрана более хрупкая, но при аккуратной работе это незаметно.


  • По пунктам

    п. 1.

  • Обрезать ли гель, оставив лишь область, которую вы хотите увидеть на картинке до переноса, после переноса или вообще не обрезать, зависит от вашего желания экономить мембрану и антитела.
  • п.4.

  • Можно в ванночке с гелем.
  • п. 6.

  • Но лучше всё накладывать сразу без пузырей.
  • п. 7.

  • Или ~3mA на индивидуальную полоску.
  • п. 8.

  • Иногда полезно отметить положение границ геля, лунок и т.п.
  • п. 11.

  • Можно проконтролировать как много белка осталось в геле после переноса покрасив гель.


  • Гибридизация

  • Фильтр всегда должен быть влажным.
  • Высохшую PVDF мембрану нужно смачивать метанолом.
  • Соприкасаться с раствором должна сторонаP(на которую шел перенос).
  • Гибридизация с а/т проводится в гибридайзере при 26oC в маленьких цилиндрах или 50ml ЦФ-пробирках. Объём гибридизационного раствора ~3ml (по возможности минимальный, но чтобы мембрана не подсыхала).
  • Отмывка и забивка: при NT покачивая в ванночке (крышке от типов) V=30-50ml.
  • п. 16.

  • Раствор либо выбросить, либо в нем же проводить гибридизацию, только не надо капать на фильтр концентрированные а/т.
  • Для забивки неспецифики лучше всего использовать сухое молоко, (можно и BSA, но он нам нравится меньше). Разные партии несколько отличаются между собой по интенсивности фона.
  • п. 17.

  • Налить гибридизационный раствор в 50ml ЦФ-пробирку, добавить нужное количество а/т, смешать. Проложить фильтр по стенке пробирки, поставить в гибридайзер.
  • Если вы не знаете в каком разведении работают а/т, то вам придётся определить это экспериментально.
  • Время взаимодействия с антителами можно увеличивать или уменьшать в зависимости от ваших антител.
  • Гибридизация проводится в 0.1-0.15М NaCl, снижение ионной силы вызывает сильную неспецифическую гибридизацию.
  • п. 18.

  • Очень важно!!! Раствором с антителами можно пользоваться несколько раз (5-7). Достаточно заморозить его после использования на -20oС. Эта процедура работает по крайней мере для гибридизационного буфера: 1x PBS(without Mg++/Ca++), 0.3-1.0% Dry milk, Antibodies.
  • п. 20.

  • При иммуноокрашивании после иммунопреципитации фон можно убрать преконъюгировав предварительно вторичные антитела с первичными .
  • Приведённая процедура - не единственная. Варианты:
    1. Все делать при NT на качающейся платформе, гибридизация и забивка в целлофановых пакетах (Vраствора ~1.5мl, в зависимости от размера фильтра), отмывка в ванночке:
      1. забивка: 3% сухое молоко, 1х PBS, 30-40';
      2. "I"а/т: 1h 0.3% сухое молоко, 1х PBS, антисыворотка;
      3. отмывка 3 раза х 5': 1х PBS, 0.05% Tween-20;
      4. "II"а/т: 30' в 1х PBS;
      5. отмывка как в п.3.

      Несмотря на существенно более низкое содержание сухого молока в гибридизационном буфере для "I"а/т и полное его отсутствие в буфере для "II"а/т этот метод давал чистые картинки. Видимо, успех определялся качеством использованных а/т.

    2. Отмывка и забивка проводятся в ванночке. Гибридизация: на стол положить кусок парафильма (больше мембраны), на него - 0.5-1ml гибридизационного раствора с а/т. Положить мембрану стороной (Р) к раствору, избегая пузырей, сверху прикрыть куском парафильма размером с мембрану. Инкубировать 1h.
    3. Этот способ сокращает объём гибридизационной смеси, но может ухудшить качество гибридизации.

    п. 27.

  • Максимум свечения наступает через 4-5' после нанесения раствора (разумная интенсивность свечения сохраняется в течение 15-20').



    Дополнение от Алексея Терентьева (alexei@icp.ac.ru)

    На самом деле, качество Вестерна от способа проявки, в общем, не зависит (при соблюдении технологии ЕСL, конечно). Сильно зависит от наличия антигена и качества антител. Несколько рекомендаций, которые могут помочь:

    • Всему миру известно, что покупка антител (особенно от Santa Cruz) - дело рискованное, можно приобрести нечто, либо узнающее все подряд, либо не узнающее ничего. Посмотрите по статьям, какими антителами и из какого источника люди пользуются для ваших антигенов.
    • Первичные антитела (да и вторичные тоже) имеют свойство портиться со временем (прежде всего, из-за инфекции). Добавьте в первичные антитела азид натрия до 0.02% - тогда вы сможете использовать их очень (действительно очень) долго (хранение при +4), и уж конечно более 5-7 раз, как это говорится на molbiol.ru.
    • Качество вторичного антитела тоже значит много (я не могу сравнивать ни с чем, поскольку всегда пользовался только амершамовскими).
    • Никогда не добавляйте азид натрия во вторичные антитела (он убивает пероксидазу). Вообще, разбавленные вторичные антитела недельной давности рассматриваются как плохие, но если не жалко лишних 4-5 часов работы, можете рискнуть их использровать.
    • В случае проблем можно попробовать другой блокирующий агент ("BSA фракция V" или сухое молоко).
    • Важно(!) Вестерн с некоторыми первичными антителами работает очень хорошо и чисто, если во вторичные антитела блокирующий агент (BSA или сухое молоко) не добавлен вообще.
    • Кстати, работать в перчатках абсолютно необязательно.

    Дополнения, комментарии, вопросы

    terale /08.09.2005 01:00/
    Глубокоуважаемые администраторы сайта молбиол!

    Я получил новые вопросы по вестерну. Возможно, они пригодятся кому-то еще. Вопросы были следующего содержания:
    1. сколько и где хранить (+4 или -20) стоковый раствор люминола?
    2. где и сколько можно хранить стоковый раствор кумаровой кислоты.


    Ответы примерно следующие:
    1. Для растворения люминола (который "Раствор B") колба ставится на магнитную мешалку с небольшим подогревом на несколько десятков минут (люминол очень плохо растворяется). Во избежание яркого света колбу рекомендуется накрыть чем-нибудь. Однажды мы забыли колбу на 3 часа и нагрелась она градусов до 60-70, но ничего, работал отлично.
    2. Раствор люминола разливается по 14 мл в пластиковые 15-мл пробирки.
    2. Раствор кумаровой кислоты (который "Раствор A") разливается по 150 мкл в эппендорфы (для реакции нужно 140 мкл, но разливать в эппендорфы нужно с запасом по причине определенной неточности пипеток).
    3. Оба раствора хранятся при -20. Обычно готовится сразу месячный запас люминола (например, на 10 вестернов - 140 мл) и соответствующее количество кумаровой
    кислоты, разливается, замораживается и используется пока не кончится. 2-3 месяца с ними ничего не случится (проверено на практике).
    4. Растворы размораживаются непосредственно перед
    употреблением в водяной бане с теплой водой, а 150 мкл кумаровой кислоты в эппендорфе можно разморозить просто в руке за 2-3 минуты.
    5. Необходимо убедиться в свежести перекиси, которую планируется использовать. Мы просто попросили в ближайшей аптеке и нам налили свежайшего раствора.
    6. Сама процедура выполняется примерно так: размораживаем 1 пробирку люминола, прямо в нее добавляем 140 мкл кумаровой кислоты, прямо туда же добавляем 5 мкл перекиси, закрываем пробирку, перемешиваем, открываем пробирку, выливаем на наш хайбонд, инкубируем 1 мин, можно прикладывать пленку.

    С уважением,

    Алексей Терентьев (alexei@icp.ac.ru)

    PS. Никак не пойму, как тут отправляются сообщения, прошу меня извинить, если эти сообщения придут несколько раз.



    Гость /21.09.2005 20:50/
    можно ли для буфера для переноса использовать вместо метанола этанол?



    Tom1 /21.09.2005 22:30/
    Нет проблем пользуйте сам пользовал...



    Tom1 /21.09.2005 22:48/
    Маленький дополнений к прописи люминола и кумаровой кислоты....
    Имхо все это шаманство люмином на мешалка 3 часа пару раз побултыхал и порядок да банку согласен надо фольгой завернуть .... да храним на +4 правда нам политры хватает максимум на месяц....
    А кумаровую кислоту вообще при комнатной храним месяцами и никаких проблем не было....
    Да и последнее перекись прямо в люминол льем.....



    Oleg Klychnikov /21.09.2005 23:30/
    кстати, по-поводу переки, прикольно хранить ее
    довольно глубоко в холоде... (т.к. она разлагается
    на воду, которая вымерзает....) так, что у вас будет все
    время одинаковое ее количество...



    Guest /22.09.2005 19:04/
    http://www.molbiol.ru/forums/style_images/1/p_thanks.gif ( http://www.molbiol.ru/forums/style_images/1/p_thanks.gif ) Tom1



    Oleg Klychnikov /22.09.2005 19:16/
    (Guest @ 22.09.2005 17:04)
    Ссылка на исходное сообщение  http://www.molbiol.ru/forums/style_images/1/p_thanks.gif ( http://www.molbiol.ru/forums/style_images/1/p_thanks.gif ) Tom1

    остро, по заграничному! (с) lol.gif
    Том1 ты чеж это не залогинился? смотри, превратишься в Гобочку....
    tongue.gif



    Tom1 /22.09.2005 20:26/
    "....смотри, превратишься в Гобочку..."
    Типун тебе на язык это был не я.....
    Видать ППГ и за меня решил взяться....
    Да ждет меня судьба Урри.... а у меня даже маски нет......weep.gif



    Гость /11.01.2006 02:05/
    Глубокоуважаемые модераторы, у наших коллег возникают разные вопросы. Возможно, приведенная ниже переписка будет полезна кому-то еще. Прилагаю ее без редактирования, как есть.

    С уважением,

    Алексей.

    Привет, Ирина.

    Извините, что ответил не сразу. Мой адрес попал в базу данных спамовцев, и я борюсь со спамом каждый день не на жизнь, а на смерть. Из сотни сообщений одно-два смысловых, остальное - мусор. Вот, дошел и до Вашего письма....

    Сразу по пунктам.
    1. Лизирующий буфер: выбор зависит от свойств белка и его внутриклеточной локализации. Для мембранных - один буфер, для ядерных - другой и т.д. и т.п. Ничего нового я, конечно, не скзал, но, наверное, лучший способ - посмотреть, какие буферы используют Ваши коллеги на том же или похожем белке (по статьям).
    Не будет ничего удивительного, если какой-то белок, например, ядерного матрикса просто не войдет в гель по причине того, что не растворился. К слову, один из распространенных способов лизиса - буфер Лэмли. Правда, после растворения ткани в нем нужно будет позаботиться о разрушении ДНК (ультразвук, шприц с тонкой иглой), иначе на гель такую кашицу не нанести. У меня есть несколько рецептов лизирующих буферов. Если Вы не найдете в пабмеде ничего, я их вышлю (правда, никакой экзотики в них нет, к тому же хорошо было бы знать хотя бы какие-то свойства Вашего белка, чтобы быть более конкретным).

    2. Фракционирование, наверное, будет дешевле, чем иммунопреципитация. Ничего не поделаешь - это наша работа. Если надо фракционировать - будем фракционировать (или иммунопреципитировать)... Фотошоп - только если Вы уверены в том, что нарисованное Вами соответствует действительности (хотя даже эта уверенность бывает обманчива, посему, если Вам дорого Ваше будущее, хочу Вас от этого отговорить). Нормальные рецензенты имеют те же проблемы, что и Вы, поэтому фраза типа "неидентифицированные полосы" им понятна. От ненормальных рецензентов никто из нас не застрахован (smile).

    3. Преабсорбция... Честно признаться, не совсем понял проблему и цель забивки антител.
    Лишние полосы - ВНИМАНИЕ!!! НЕ ПРОХОДИТЕ МИМО ОТКРЫТИЙ!!!
    Если лишние полосы расположены ВЫШЕ Вашего белка - это могут быть модификации, которые связаны с: фосфорилированием, ацетилированием и т.п. (масса белка увеличивается несильно) либо (!!!) убиквитинирование, сумоилирование и т.п. (масса белка увеличивается где-то на 20 КДа, причем иногда, если Вы везучая, возникает характерная лесенка фрагментов - БЕЛОК-БЕЛОК+20Кда-БЕЛОК+40Кда и т.д.) - мои поздравления, вы стоите на пороге одной из наиболее модных областей в современной протеинологии. Если лишние фрагменты НИЖЕ Вашего белка - к сожалению, это, скорее всего, протеолиз в ходе лизиса ткани и последующих манипуляций. Нужно найти более мощный ингибитор протеаз (а лучше сразу несколько), чем те, что Вы используете. О +4 градусах по Цельсию говорить, я думаю, излишне.

    4. Никаких особых отличий в работе с моно- и поликлональными антителами нет. Вестерн (при прочих равных) ведется абсолютно одинаково. Моноклональные иногда дают более чистый сигнал (хотя это зависит от типа белка, его концентрации, метода лизиса и т.д. поликлоны могут быть абсолютно также хороши, как и моноклоны), и они, как правило, дороже. Именно поэтому для иммунопреципитации лучше пользоваться поликлональными. Для иммунопреципитации с моноклонами часто приходится использовать белок G (который также дороже, чем белок А). Таблицу использования белков А и G с разными типами антител можно найти, например, в биорадовском каталоге. Часто используют такой прием: иммунопреципитация поликлональными антителами - вестерн с моноклональными (наоборот - дороже, но тоже можно), во избежание регистрации сильно фонящих иммуноглобулинов. Если масса Вашего белка сильно отличается от 50 и 25 КДа (где-то там будут тяжелая и легкая цепи иммуноглобулинов, дающие замечательный сигнал на вестерне), то можно и преципитацию, и вестерн вести на одних и тех же антителах.

    5. Удачи!

    С уважением,

    Алексей.

    ----- Original Message -----
    From: Irina Corin
    To: alexei@icp.ac.ru
    Sent: Monday, June 23, 2003 4:28 PM
    Subject: WB


    Privet Alexei,

    S interesom prochitala vashi rekomendacii. I hotya moi metod raboty s WB poryadochno otlichaetsya ot vami opisannogo,

    Hotelos by obsudit nekotorye detali, kotorye mne ne ochen udayutsya.

    Vozmozhno vy podelitis vashim opytom ili porekomenuete mne kogoto, kto na ,,nizheperechislennom sobaku s,el,,.

    Prigotovlenie kletochnogo extracta iz tkani opuholi grudi. Rezultat WB otlichaetsya pri ispolzovanii raznyh protokolov.
    Mne prihoditsya peregruzhat gel, t.k. interesuyuschii belok v ochen nizkoi koncentracii. Sootvetstvenno uzhasnaya i neubirayuschayasya nespecifika. Nahozhus pered vyborom Frakcionirovanie, Immunoprecipitaciya ili Fotoshop??
    Na WB proyavilos neskolko polos s silnym signalom , kotorye podozrevayutsya kak ,, privedeniya,, . Chto by vyyasnit ih lichnost hochu provesti preabsorbciyu pervichnyh antitel s rekombinantnym belkom, kotoryi uzhe kuplen. Problema v tom, chto ya ni razu etogo ne delala i byla by rada sovetam i poskazkam.
    Do sih por rabotala tolko s monoklonalnymi AB (kstati ot Santa Cruz) . Predstoit odolet Rabbit Polyclonal AB. Kakie osobennosti v rabote s poliklonalnymi? Slyshala, chto oni huzhe
    Konechno imeetsya esche kucha melkih voprosov i detalei, no kak izvestno peregruzka kak gelya , tak i naroda vliyaet na kachestvo rezultata.



    Zaranee blagodarna,

    Irina..



    Гость /11.01.2006 03:09/
    ПОВЕРХНОСТНЫЙ ИММУНОБЛОТТИНГ
    Процедуры переноса белков из геля на мембрану зачастую можно не выполнять!!!!! (A.Y.Plekhanov Immunoreplica from the gel surface: rapid and sensitive blot plus intact gel.- Anal. Biochem., 1996, v.239, 110-111), а лишь наложить на гель мембрану (прикатать пробиркой для плотного прилегания) и выдержать 5 - 10 минут. Другую мембрану можно приложить к гелю с обратной стороны.
    Чувствительность иммуноблоттинга при этом остаётся высокой (в наших условиях - ок. 5 нг антигена, содержащегося в геле, при проявлении пероксидазной метки антител бензидином).
    Заметим, что из геля на мембрану при этом переносится лишь ничтожная часть белка с сАмой поверхности геля. Основная же масса белка остаётся в геле, что позволяет использовать гель так, как если бы с него не снималось никаких иммунореплик (окрашивание белковых зон в геле, электрофорез во втором направлении...)
    Попробуйте! Вы в любом случае ничего не теряете: если в вашем случае метод не подойдёт - вы можете получить иммунореплику обычным путём (все белки же остались в геле!)
    А.Ю.Плеханов

    ПРОЯВЛЕНИЕ ИММУНОРЕПЛИКИ БЕНЗИДИНОМ
    Далеко не всегда оправданно применение ECL: это дорого, не всегда нужна такая сверхчувствительность, да ещё плёнку проявлять... На самОм же блоте при этом никаких зон не видно.
    Окраска бензидином (A.Y.Plekhanov - Anal. Biochem., 1996, v.239, 110-111) чувствительнее, чем диаминобензидином, фенилендиамином или нитрозо-нафтолом (хотя, конечно, менее чувствительна, чем ECL). Для тех, кто не в курсе: зоны антигенов при этом проявляются прямо на мембране, и окраска сохраняется неограниченно долго.
    ПРАКТИЧЕСКИ, после отмывки мембраны от вторичных антител, её следует ополоснуть в дист. воде и поместить для проявления в раствор состава: 0,05% бензидина, 0,03% Н2O2, 0,002M лимонная кислота, 0,004М Na2НРО4 (рН 5). Перекись и бензидин добавляются перед применением. Бензидин удобно добавлять исходя из 5%-ного маточного раствора на спирту, затем проявляющий раствор следует подогреть до прозрачности, остудить до температуры ниже 40'С и проявлять. По окончании проявления мембрану промыть тёплой (40-50'C водой).
    Если вы пользуетесь ECL, ПОПРОБУЙТЕ, по окончании экспозиции на плёнке, ополоснуть мембрану/фильтр/блот дист. водой и опустить в проявляющий раствор с бензидином - зоны у вас будут проявлены не только на плёнке, но и на самом блоте.
    А.Ю.Плеханов.



    _Dimych_ /11.01.2006 20:13/
    Troubleshooting protein binding in nitrocellulose membranes
    http://www.devicelink.com/ivdt/archive/99/03/009.html ( http://www.devicelink.com/ivdt/archive/99/03/009.html )

    Blocking strategies for nylon membranes used in enzyme-linked immunosorbent assays
    http://www.devicelink.com/ivdt/archive/97/07/012.html ( http://www.devicelink.com/ivdt/archive/97/07/012.html )

    The use of microporous polymer membranes in immunoassays
    http://www.devicelink.com/ivdt/archive/96/05/007.html ( http://www.devicelink.com/ivdt/archive/96/05/007.html )



    nazen /06.02.2006 15:24/
    Здравствуйте! Я новичок в блотинге. У меня есть масса вопросов связанных с методикой приведенной ниже. Может они вам покажутся глупыми, но все-таки помогите в объяснении.
    1. Чем отличается полусухой перенос от обычного и какое оборудование используется в 1ом и во втором случае.
    2.Что такое куски Whatman 3 ММ, я знаю ватман обычный, но в силу своей неопытности хочу убедиться это он или не он.
    3. В данной методике написан рецеп TS является ли он универсальным, т к у меня в инструкции к аппарату для блотинга написан состав TS немного с другими количествами компанентов.
    4. И наконец, я не понимаю, что приоритетней напряжение,которое я выставляю на аппарате, примерно 14V или силу тока mA/см2.
    Объсните пожайлуста!!! Плиззззз!



    Коля2 /06.02.2006 17:38/
    (nazen @ 06.02.2006 15:24)
    Ссылка на исходное сообщение  Здравствуйте! Я новичок в блотинге. У меня есть масса вопросов связанных с методикой приведенной ниже. Может они вам покажутся глупыми, но все-таки помогите в объяснении.
    1. Чем отличается полусухой перенос от обычного и какое оборудование используется в 1ом и во втором случае.


    Обычный делается в том же станке, что и форез, только вместо стекол ставят кассету. Расход буфера - по объему форезной камеры. Для полусухого нужен специальный прибор с двумя большими электродами, между которыми закладывают кассету с гелем и нитроцелюлозой, обложенными фильтровальной бумагой. Расход буфера на порядок меньше.


    (nazen @ 06.02.2006 15:24)
    Ссылка на исходное сообщение
    2.Что такое куски Whatman 3 ММ, я знаю ватман обычный, но в силу своей неопытности хочу убедиться это он или не он.


    Обычный ватман - это бумага чертежная, а 3ММ - фильтровальная, американская smile.gif

    (nazen @ 06.02.2006 15:24)
    Ссылка на исходное сообщение
    3. В данной методике написан рецеп TS является ли он универсальным, т к у меня в инструкции к аппарату для блотинга написан состав TS немного с другими количествами компанентов.


    Работайте по инструкции производителя (хотя, возможно, это не принципиально).


    (nazen @ 06.02.2006 15:24)
    Ссылка на исходное сообщение
    4. И наконец, я не понимаю, что приоритетней напряжение,которое я выставляю на аппарате, примерно 14V или силу тока mA/см2.


    Блоттинг должен идти при постоянном напряжении, а форез - при постоянной силе тока.



    Гость /18.03.2006 10:39/
    Здравствуйте! Есть ли у Вас опыт блоттингового определения HIF-1a. Кыргызский научный центр гематологии зпланировал определение HIF-1a. Возможно-ли наладить данную методику и какое лабораторное оборудование необходимо для определения HIF-1a. У какой фирмы можно закупить оборудование.
    Айнура Макешова, Кыргызстан
    (AinuraMak@mail/ru



    Klimenko /15.05.2006 09:54/
    Здраствуйте,
    Я пока еще новичок в блоттинге. И у меня вопрос по поводу применения вместо метанола этанола для PVDF мембраны.
    Пожалуйста, ответьте
    Оксана



    Batareykin /15.05.2006 09:57/
    (Klimenko @ 15.05.2006 07:54)
    Ссылка на исходное сообщение  Здраствуйте,
    Я пока еще новичок в блоттинге. И у меня вопрос по поводу применения вместо метанола этанола для PVDF мембраны.
    Пожалуйста, ответьте
    Оксана


    сам не пробовал (использую только conventional methanol), однако мастера этого метода (Том1....) говорят, что можно.



    E. /15.05.2006 10:05/
    (Klimenko @ 15.05.2006 09:54)
    Ссылка на исходное сообщение  Здраствуйте,
    Я пока еще новичок в блоттинге. И у меня вопрос по поводу применения вместо метанола этанола для PVDF мембраны.
    Пожалуйста, ответьте
    Оксана


    Оксана, почитайте внимательно данную ветку.
    сообщения 3 и 4: wink.gif

    (Гость @ 21.09.2005 20:50)
    Ссылка на исходное сообщение  можно ли для буфера для переноса использовать вместо метанола этанол?


    (Tom1 @ 21.09.2005 22:30)
    Ссылка на исходное сообщение  Нет проблем  пользуйте сам пользовал...




    Batareykin /15.05.2006 10:11/
    (E. @ 15.05.2006 08:05)
    Ссылка на исходное сообщение  Оксана, почитайте внимательно данную ветку.
    сообщения 3 и 4:     wink.gif


    во, блин - любитель пива и канабиса прав - помню, что где-то томову посту читал - а где, не помню smile.gif



    Klimenko /15.05.2006 11:47/
    Спасибо, большое.
    Сегодня же и опробую.



    guyahoga /15.05.2006 17:25/
    (Коля2 @ 06.02.2006 15:38)
    Ссылка на исходное сообщение  Блоттинг должен идти при постоянном напряжении, а форез - при постоянной силе тока.

    А мы делаем прямо наоборот!!! Это принципиально?!?!?!



    ммм /15.05.2006 19:41/
    --- мы делаем прямо наоборот!!! Это принципиально?!?!?!

    Правильные пацаны все делают при постоянной силе тока. smile.gif

    Это не принципиально.

    Если вы откроете школьный учебник физики и немножко подумаете, то быстро поймете в чем разница.



    mesentsev /17.05.2006 17:24/
    Вторичные козьи антитела

    По-моему, это знают почти все, кто сталкивался с Western'ом, но в данной ветке я почему-то этого не нашел (может плохо искал- не знаю smile.gif

    В принципе, с козьими антителами инкубировать нужно в молоке или "другом блокирующем реагенте".
    Совет, вобщем-то, хороший. Я, в свое время, его попробовал и не получил сигнала вообще. Чтобы такой ситуации не возникало в принципе, нужно подобрать разведение молока (или того, что в Вашей лабе привыкли использовать) для данного конкретного brand'a вторичных антител. Я рекомендую это делать последовательным разведением молока 1:3 от блота к блотy, пока не появится картинка нужного Вам качества.

    Например, для goat anti-rabbit поизводства Jackson Immunoresearch (Cat# 111-035-003) подходит 0.5% Carnation Instant Nonfat Dry milk fortified with vitamins A & D. Не самое лучшее молоко, но в отличие от того что продает Fisher или Bio-Rad оно раз в пять или шесть, по-моему, дешевле и вполне работоспособно, если его фильтрануть через бумажный фильтр.



    Гость /02.08.2006 11:05/
    При подборе условий для переноса (особенно для больших белков, когда требуются более длительные времена - до 90 минут) очень удобны для контроля переноса на мембрану флуоресцентно-меченые маркеры. Тогда еще до проявления мембраны понятно прошел перенос или нет. В Sigma - они дорогие, а вот Fermentas выпускает их по вполне сносной цене - 1-2 мкл вполне достаточно на дорожку.



    airat-kayumov /17.10.2006 13:34/
    Vsem privet!
    U menja takaja problema. Projavljaju blott ECL, a tam gutkij background, xotja moi belkovye bandy toge est'. Shef govorit chto problema v II antitelax, chto lipnut vezde kuda ne nado. Zabivku vedu 1 h v 10% moloke, ran'she vse rabotalo... Nikto ne stalkivalsja s takoj problemoj? Pomogite please!!!



    hellga /10.12.2006 18:42/
    (Гость @ 10.01.2006 23:05)
    Ссылка на исходное сообщение  
    4. Никаких особых отличий в работе с моно- и поликлональными антителами нет. Вестерн (при прочих равных) ведется абсолютно одинаково. Моноклональные иногда дают более чистый сигнал (хотя это зависит от типа белка, его концентрации, метода лизиса и т.д. поликлоны могут быть абсолютно также хороши, как и моноклоны), и они, как правило, дороже. Именно поэтому для иммунопреципитации лучше пользоваться поликлональными. Для иммунопреципитации с моноклонами часто приходится использовать белок G (который также дороже, чем белок А). Таблицу использования белков А и G с разными типами антител можно найти, например, в биорадовском каталоге. Часто используют такой прием: иммунопреципитация поликлональными антителами - вестерн с моноклональными (наоборот - дороже, но тоже можно), во избежание регистрации сильно фонящих иммуноглобулинов. Если масса Вашего белка сильно отличается от 50 и 25 КДа (где-то там будут тяжелая и легкая цепи иммуноглобулинов, дающие замечательный сигнал на вестерне), то можно и преципитацию, и вестерн вести на одних и тех же антителах.

    Алексей.



    Подскажите, пожалуйста, как наносить образец на гель после иммунопреципитации с сефарозой! Вот я добавила к сефарозной "лепешке" буфер для нанесения на гель, прокипятила 5 мин... А дальше? В карман нужно наносить только супернатант или пытаться засунуть туда и шарики сефарозы? Если да, то как? Срезанным носиком у меня не получается - они тящелые и падают на дно пробирки, как ни пипетируй! Или я могу быть уверена, что весь преципитированный белок перешел в буфер и в сефарозе ничего не осталось?
    Заранее спасибо



    Tom1 /10.12.2006 23:42/
    кипятте фугуите и наносите супер.....



    guest: ммм /11.12.2006 16:13/
    --U menja takaja problema. Projavljaju blott ECL, a tam gutkij background, xotja moi belkovye bandy toge est'. Shef govorit chto problema v II antitelax, chto lipnut vezde kuda ne nado.

    Нужно немножко развести коньюгат. Если не поможет, то дело возможно в первых антителах или в плохом ECL



    Tom1 /11.12.2006 16:27/
    1.согласен с воприемником.
    2. Если антитела ( первичные) козлины то вторичные обязательно делать в блокирующем буфере!!! иначе труба....
    3. Настораживает "хотя мои белковые банды тоге есть " их что много??????



    guest: Александра /14.02.2007 19:59/
    Я веду окраску блота последовательно двумя разными первичными АТ (на один белок и на другой), а затем все это вместе инкубирую со вторичным (благо одно и то же к обоим первичным). Так вот возник такой вопрос. Кто знает можно ли смешать в одном пузырьке оба первичных (оба мышиных) антитела (для экономии времени при оьработке) с учетом их последующего длительного хранения (использования)?



    guest: ммм /14.02.2007 20:12/
    Кто знает можно ли смешать в одном пузырьке оба первичных (оба мышиных) антитела.

    Можно, до тех пор пока не получите, какой-нибудь артефакт, связанный с неспецификой и перекрестной реакцией.



    Гость /15.02.2007 20:26/
    Спасибо



    Гость /06.04.2007 12:47/
    Пожалуйста,подскажите адреса фирм, где можно заказать аппарат для блоттинга.
    Лена



    guest: ммм /06.04.2007 15:32/
    ---Пожалуйста,подскажите адреса фирм, где можно заказать аппарат для блоттинга.
    Лена

    На этом сайте раздел фирм посмотрите Биорад и Амершам(GE)



    Гость /19.04.2007 13:39/
    Люди знающие, откликнитесь! Что делать. Понсеан окрашивание дает хорошую картинку белкового разделения. Провожу гибридизацию с моноклональными а/т GAPDH в 5% молоке 1 час , комнатная температура, отмывка,1 час вторичные тела, комн.темпер, отмывка. детекция с ЕСЛ 1 мин, пробовала 5 мин. Получаю совершенно чистую рентгеновкую пленку. Оставляю блот на ночь при 4С, утром вижу черную полосу на месте миграции GAPDH,опять пытаюсь проявить. Пленка совершенно чистая, даже нет сигнала от маркера веса.
    Пробовала с другими антителами ( другой белок) получила тоже самое. С данной нитроцеллюлозной мембраны считать ничего не возможно.
    Заранее благодарна за любые комментарии.
    Татьяна



    protein /19.04.2007 14:30/
    Или вторые АТ или ECLка. Попробуйте к 0,5мл вторых АТ в молоке или ПБСТ (ну, в чем вы их разводите) добавить 0,5мл готового раствора для ECL. И бегите в фотокомнату - если будет светится, то все Ок, проблема не там или вторые АТ не связываются. Если не светитmся - меняйте реактивы для ECL.



    Гость /19.04.2007 15:22/
    Пожалуйста, кто работал с белком мол.веса 30, какое оптимальное время переноса и напряжение; а если белок 12кДА? лучшие результаты получились при 30 V, 6 hrs,но как то неустойчиво. То есть, то нет.
    Спасибо за все ответы.



    Гость /19.04.2007 16:06/
    Спасибо Протеин. Я пробовала ЕСЛ на другом блоте, он работает, нормальная картина. А может это связано с праймеры а/т? Как вы различаете, где не работают прайймеры, а где вторичные? Заранее спасибо за комментарии
    Татьяна



    guest: ммм /19.04.2007 17:18/
    Провожу гибридизацию с моноклональными а/т GAPDH в 5% молоке 1 час , комнатная температура, отмывка,1 час вторичные тела, комн.темпер, отмывка. детекция с ЕСЛ 1 мин, пробовала 5 мин. Получаю совершенно чистую рентгеновкую пленку. Оставляю блот на ночь при 4С, утром вижу черную полосу на месте миграции GAPDH,опять пытаюсь проявить. Пленка совершенно чистая, даже нет сигнала от маркера веса.

    --Провожу гибридизацию с моноклональными а/т GAPDH в 5% молоке 1 час , комнатная температура.

    Маловато по времени 2--4 часа надо.

    --Оставляю блот на ночь при 4С, утром вижу черную полосу на месте миграции GAPDH,опять пытаюсь проявить.

    ОТКУДА !!??? У вас черная полоса??? Где вы оставляете блот на ночь? В каком растворе? или без раствора сухой?

    ----даже нет сигнала от маркера веса.

    Объясните как каким боком, у вас может появится сигнал от маркера. Там что пероксидаза в полосах или у вас есть коньюгат антител с пероксидазой к маркеру и вы их добавляете во время связывания.

    ---Пожалуйста, кто работал с белком мол.веса 30, какое оптимальное время переноса и напряжение; а если белок 12кДА? лучшие результаты получились при 30 V, 6 hrs,но как то неустойчиво. То есть, то нет.
    Спасибо за все ответы.

    Какая процентность геля? Какую камеру для переноса вы используете? Без поямнений на ваш вопрос не ответитью. какой буфер используете.
    12 кда обычно очень быстро переносится.



    Гость /19.04.2007 20:38/
    Спасибо большое за отклик. Блот оставляла на ночь при 4С в холодильнике, блокин раствор: 5% молоко в ТВС, 0,05% твин 20. Утром думаю повторить реакцию, глядь, а на блоте ткмная полоса на месте GAPDH, как обычно появляется, если антител очень много. Опять проявляю с помощью ЕСЛ, в темной комнате добавляю раствор ЕСЛ, как положено 1:1. Выдерживаю 5 минут раствор на блоте.Пленка чистая. Правда не ждала еще дополнительно 5 минут. Признательна за все обхяснения и ответы.



    Гость /19.04.2007 20:45/
    Еще раз, раствор в котором хранилась NC мембрана
    трис, NaCL, dry milk, Tween -20 0.05%.



    Гость /19.04.2007 21:18/
    Камера, которую используем - Биорадовская, процент геля для 30 кило дальтон - 10%, для белка 12 кдальтон 4-20% гель.Обычный раствор как описано здесь на сайте, но SDS не добавляем.
    Спасибо



    guest: ммм /20.04.2007 15:57/
    ---Спасибо большое за отклик. Блот оставляла на ночь при 4С в холодильнике, блокин раствор: 5% молоко в ТВС, 0,05% твин 20. Утром думаю повторить реакцию, глядь, а на блоте ткмная полоса на месте GAPDH, как обычно появляется, если антител очень много.

    Вы сами то подумайте, если у вас нет субстрата для пероксидазы в вашем растворе, откуда образовываться красителю(темному). Это значит в вашем растворе есть что-то, что реагирует с пероксидазой и дает темную полосу. Спрашивается ЧТО ЭТО?
    Ну допустим перекись может присутствовать в Твине, ну, а роль восстановителя кому отводиться?

    Про окраску маркера пероксидазой на ЕСL так и не ответили.

    ---Камера, которую используем - Биорадовская

    Вот вы интересный человек, у Биорада 3 камеры для мокрого переноса и одна для полусухого сухого. Знаете это примерно так! У вас какая краска для наружных работ или для внутренних. А в ответ: "У меня краска Шебекенского завода".

    Короче, меня интерисует мокрый или полусухой и если мокрый, какое расстояние между электродами в камере.
    Если мелкий белок бежит в градиенте, то нужны размеры геля(ток напряжение) и время фореза, что бы определить до пор какого размера добежал белок, или хотя бы где бромфеноловый синий, когда вы заканчиваете форез.



    Гость /21.04.2007 16:10/
    Net substrata dlya peroxidasi
    Ya provodila deteciyu s pomoch'yu ECL na blote, poskol'ku plenka okazalas' absolyutno chistaya, ya reshila postavit' blot in refregerator in 5% milk TBS dlya otmivki overnight.Takoy priem mi provodim vsega, kogda provodim povtornuyu detecciyu. Ya bila obespokoena tem, chto net GAPDH. I utrom reshila ege raz postavit' reaciyu.Peroxidasa bila na blote i reakciya proizoshla znachitel'no pozge.Posle togo, kak Ya postavila blot in refregerator.Povtornaya detekciya i povtornaya reacciya nichego ne dali, hotya polosa ostalas' vidna na blote.



    guest: ммм /23.04.2007 13:13/
    -ya reshila postavit' blot in refregerator in 5% milk TBS dlya otmivki overnight.

    Блот перед этим споласкивали после ECL?

    1)Капните на на кусочек мембраны сток коньюгата и забейте его молоком после этого сделайте ECL.
    Если ответ есть, то пероксидаза коньюгата работает и нужно переходить к 2). Если ответа нет, нужен новый коньюгат.
    2) Капните на кусочек мембраны первых антител забейте их молоком и проинкубируйте с коньюгатом. Потом проведите реакцию с ECL. Если ответ есть, то скорее всего у вас поганые антитела к дегидрогеназе, если ответа нет то у вас поганые антитела в коньюгате.



    Tom1 /23.04.2007 16:44/
    1.Восприемник я не перестаю удивлятся твоему долготерпению.....smile.gif
    2. Уважаемая все правильно написал "ммм", еще дополнительный вопрос, а положительный контроль у Вас имеет место быть или как??????



    guest: ммм /23.04.2007 17:11/
    Я не думаю, что люди, которые собираются выравнивать пробы по GAPDH имеют в своем арсенале чистую GAPDH от Worthington, для плюс контрля, своего контроля. wink.gif wink.gif mol.gif mad.gif wall.gif



    Tom1 /23.04.2007 17:48/
    Дык хотя бы екстракт в котором заведомо есть данный фермент ( хорошо бы провереным наличием по его активности)



    Гость /24.04.2007 05:47/
    Вы правы чистой GapDH у нас нет,пробы сравниваем - ложная операция, реальная операция.Проверила праймкры а/т и вторичные. На дот блоте хорошо себя проявили все антитела. А когда нанесла экстрагированный протеин, оказалось, что с концентрации 250 nM и меньше,ответа нет, чувстительность слабая. Количество белка, которое нагружаю - 30-35 mkg довольно прилично, почему не работает GAPDH в этих условиях - не понятно.
    Спасибо за все комментарии



    Гость /24.04.2007 05:51/
    Уважаемый А.Ю.Плеханов обязатедьно попробую Ваш метод, он быстрее, а вот как с точностью,
    С уважением, Татьяна



    guest: ммм /24.04.2007 11:48/
    А когда нанесла экстрагированный протеин, оказалось, что с концентрации 250 nM и меньше,ответа нет, чувстительность слабая. Количество белка, которое нагружаю - 30-35 mkg довольно прилично, почему не работает GAPDH в этих условиях - не понятно.

    Из ваших докладов не ясно, работают ли первые антитела на GAPDH в доте, по сравнению с чем чувствительность меньше. Как вы делали дот на GAPDH, что было материалом для пробы, какой раствор использовали для нанесения на мембрану материала.

    Одно очевидно, после экстрагирования антитела фермент не видят, вот вам и ответ - меняйте первые антитела. Они у вас кстати поли- или моноклоны и от какой фирмы. Но есть нюансы например, когда вы делали дот, раствор для нанесения не позволил связаться GAPDH с мембраной или экстрагирующий буфер разрушает АГ-детерминанту GAPDH, но понять это из ваших докладов не возможно.

    Возможно, что фирма не виновата, особенно если это моноклоны, ибо моноклоны часто не узнают белка на блоте после денатурации на форезе или при экстракции.

    -- а вот как с точностью,

    А если подумать?



    Гость /25.04.2007 15:35/
    Антитела на GAPDH - monocloni Санта Круз, в доте первые антитела на GAPDH работают, но картинку я получила инвертированную. места нанесения GAPDH светлые, весь блот черный. Буфер для отмывки антител - трис, NaCl,твин 20 0,3.
    В следующем опыте я нанесла экстрагированный белок на блот - максимальная концентрация - 250 нано грамм , раствор для отмывки тотже: трис, NaCl,твин 20 - 0,3%.затем нанесла антитела первые - GAPDH в той концентрации, в которой они работали на дот блот,затем вторые, и не получила никакого ответа.
    Возможно белок денатурирован.
    Спасибо за коментарии

    и вторые антитеда



    guest: ммм /25.04.2007 17:30/
    -Антитела на GAPDH - monocloni Санта Круз, в доте первые антитела на GAPDH работают, но картинку я получила инвертированную. места нанесения GAPDH светлые, весь блот черный. Буфер для отмывки антител - трис, NaCl,твин 20 0,3.

    Если Моноклоны есть вероятность, что они в вестерне не работают. Надо запросить Санта Кроуз по этому поводу.

    --в доте первые антитела на GAPDH работают, но картинку я получила инвертированную. места нанесения GAPDH светлые, весь блот черный. Буфер для отмывки антител - трис, NaCl,твин 20 0,3.

    Это как раз больше похоже не на работу, а на отсутствие забивки и неработающие антитела. При чем если раствор, в котором вы наносили пробу с GAPDH на дот, близок физиологическому, то похоже что эти антитела не будут работать и в имуноприципитации и почти верняк не будут работать в ИФА.

    Собирайте результаты и шлите рекламации санте.



    Glebber /25.04.2007 19:13/
    (Гость @ 25.04.2007 14:35)
    Ссылка на исходное сообщение  Антитела на GAPDH - monocloni Санта Круз, в доте первые антитела на GAPDH работают, но картинку я получила инвертированную. места нанесения GAPDH  светлые, весь блот черный. Буфер для отмывки антител - трис, NaCl,твин 20 0,3.


    Q. Why do I get a negative image on my Western blots? The bands are either white, clear or outlined in black with a low to moderate gray background across the blot.

    A. Excess reporter enzyme (horseradish peroxidase) in a small area can rapidly exhaust its substrate in the short time it takes to move the membrane from the detection reagents to film (or a CCD camera or scanner).
    You may be able to visualize your bands by returning the membrane to the detection reagent solutions for 5 – 10 minutes and then repeating the detection. The long-term solution is to reduce the secondary antibody dilution (or whichever antibody is conjugated to the reporter enzyme) or to load less protein onto the gel, thereby decreasing the amount of target.

    Click here for more information about Western Blotting

    http://www5.gelifesciences.com/aptrix/upp0...&moduleid=46948 ( http://www5.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/content/1233776236F2AEFDC12571BD00811B23?OpenDocument&Path=Catalog&Hometitle=Catalog&entry=4&newrel&LinkParent=C1256FC4003AED40-7E830C30C85D6F7CC125701900490F86_RelatedLinksNew-F4C08DDBD0F916F1C12571420072696F&newrel&hidesearchbox=yes&moduleid=46948 )



    Ольга Л. /14.05.2007 17:09/
    mesentsev
    Постоянный участник



      17.05.2006 18:24                    URL #23 

    --------------------------------------------------------------------------------


    Например, для goat anti-rabbit поизводства Jackson Immunoresearch (Cat# 111-035-003) подходит 0.5% Carnation Instant Nonfat Dry milk fortified with vitamins A & D. Не самое лучшее молоко, но в отличие от того что продает Fisher или Bio-Rad оно раз в пять или шесть, по-моему, дешевле и вполне работоспособно, если его фильтрануть через бумажный фильтр.


    Подскажите, пожалуйста, а где вы покупаете это молоко Carnation? Если Вы в России, конечно.
    И какое еще сухое молоко можно использовать, чтобы было дешево и сердито?

    Заранее спасибо!



    guest: ммм /14.05.2007 18:17/
    Дешево и сердито это купи молоко и отцентрифугируй. Ну это вооще экстрим.

    А так любое сухое молко в котором содержание жира на сухой вес не превышает 2.5%. В Рассейских Гостах такое молоко должно встречаться, его технологи еще называют сухой обрат. Импортное молко для культуристок и др. фитнес-телок бывает с содержанием жира 0.5% - это ваще супер и растворяется хорошо. Рассейское обычно продают на каких-нибудь пищевых развалах в ларьках, фасованное в ПЭ мешки в ручную. Из-за истекшего срока хранения или неправильного хранения может быть прокисшим. Так что рекомендую его пробовать, прежде чем покупать и растворяется оно хуже чем иноземное.
    Еще рассеское можно пошукать по пищевым(кондитерские фабрики, фабрики мороженного,майонезные производства итд) и молочным комбинатам, если знакомые там работают - можно спросить.



    Гость /24.05.2007 16:05/
    О, тут я вижу буфер переноса совсем даже не Товбиновский используется, да? Т.е. даже ну вобще не он, а какая-то, наверное, очень продвинутая модификация его... и pH у него наверно выше 10, ну может это и к луччему, больше basic proteins перенесётся... надо же, а мы всё по-старинке, классическим товбином переносим, а тут такой прогресс уже, век живи - век учись..



    Guest /25.05.2007 14:14/
    http://www.nature.com/nmeth/journal/v2/n1/...meth0105-79.pdf ( http://www.nature.com/nmeth/journal/v2/n1/pdf/nmeth0105-79.pdf )



    Гость /05.12.2007 16:14/
    Здравствуйте, коллеги!
    Првый раз ставлю блоттинг, на оборудовании Bio-Rad. Маленький белок, 10кДа. Есть какие-то особенности, подводные камни. Может кто знает?
    Наталья



    guest: Гость /05.12.2007 18:30/
    Нет никаких особенностей (имела дело с белком массой 8 кДа) - 10% ПААГ.



    Guest /05.12.2007 18:52/
    Может, лучше 15% ПААГ взять?Получше полоска сконцентрируется.
    На что блотить будете (PVDF, нитроцеллюлоза)?



    Гость /06.12.2007 10:42/
    Собираюсь делать 15% гель и переносить на нитроцеллюлозу. Держу в руках ячейку для транс-блотинга и не знаю сколько TS буфера сколько буфера лить. До покрытия рамок? Это получается не "сухой перенос", а мокрый.



    Guest /06.12.2007 19:41/
    http://www.bio-rad.com/cmc_upload/0/000/01...0/M1703930E.pdf ( http://www.bio-rad.com/cmc_upload/0/000/01...0/M1703930E.pdf )

    если вы первый раз ставите блоттинг, то прочитайте это (думаю, у вас эта камера. или другая?)
    конечно, до покрытия рамок. зачем сухой перенос?



    Guest /06.12.2007 19:42/
    то есть такая ссылка
    www.bio-rad.com/cmc_upload/0/000/013/280/M1703930E.pdf



    Era2007 /27.02.2008 16:10/
    Добрый день!
    Уважаемые форумчане, ответьте мне, пожалуйста, на такой вопрос: какой эндогенный контроль лучше использовать при детекции уровня экспрессии белков, скажем, у больных и у здоровых индивидов? И нужен ли такой контроль? Заранее спасибо за ответ.



    guest: ммм /27.02.2008 18:11/
    Я всегда выравнивал по общему белку. Это и есть контроль.

    Можете вырвнивать по гистонам(если найдете к ним антитела), по GAPDH, по актину.

    Все еще зависит от того какая ткань, сколько и какого в ней ВКМ, какое отношение объема цитоплазмы к ядру и тд итп. Какой белок ядерный, цитоплазматический, внеклеточнный.

    Проще всего почитать статьи про данный конкретный белок и его уровень и способы его измерения. Там можно найти много полезного.



    Гость /28.02.2008 01:59/
    Услышал про методику Western'а, где перенос на мембрану не требуется - как я понял, окраска антителами произовится прямо в геле. Вроде бы это какой-то kit. Поискал в сети, но ничего не нашел.

    Может кто-нибудь об этом тоже что-то слышал и подскажет, где искать?

    Спасибо!



    Guest /28.02.2008 02:05/
    Pierce делает такие

    http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=01041115 ( http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=01041115 )



    akimovster /11.07.2008 09:09/
    Друзья! Нет ли какой нибудь альтернативы метанолу и сухому молоку?



    akimovster /11.07.2008 10:15/
    Друзья! Какова роль метанола в этом методе?



    Ale-x /11.07.2008 11:41/
    (akimovster @ 11.07.2008 09:09)
    Ссылка на исходное сообщение  Друзья! Нет ли какой нибудь альтернативы метанолу и сухому молоку?


    Этанол, 40%, и БСА.



    guest: ммм /11.07.2008 12:49/
    Метанол можно заменить этанолом. Сух молоко казеином желатином альбумином и даже твином 20 или Тритоном Х-100.



    Ale-x /11.07.2008 13:09/
    (guest: ммм @ 11.07.2008 12:49)
    Ссылка на исходное сообщение  Метанол можно заменить этанолом. Сух молоко казеином желатином...


    Да, коктейль "White Russian" и лимонное желе на закусь smile.gif



    akimovster /14.07.2008 10:06/
    Этанол, 40%, и БСА.
    БСА в какой коцентрации? и Вчём растворять?



    guest: ммм /14.07.2008 16:51/
    --БСА в какой коцентрации? и Вчём растворять?
    А молоко в чем растворяете?



    Гость /15.07.2008 11:31/
    А почему этанола 40%, а не 20, как метанола?



    Guest /16.07.2008 17:16/
    Что такое БСА ? бычий сывороточный альбумин ?



    akimovster /23.07.2008 05:58/
    Да,БСА - бычий сывороточный альбумин.



    akimovster /23.07.2008 06:00/
    "Этанол, 40%, и БСА."
    Кто проверял?
    Этанол точно работает в 40% концентрации?



    Ale-x /23.07.2008 10:25/
    (akimovster @ 23.07.2008 06:00)
    Ссылка на исходное сообщение  "Этанол, 40%, и БСА."
    Кто проверял?
    Этанол точно работает в 40% концентрации?


    Всю жизнь так работаю.



    Ale-x /23.07.2008 10:26/
    (akimovster @ 14.07.2008 10:06)
    Ссылка на исходное сообщение  Этанол, 40%, и БСА.
    БСА в какой коцентрации? и Вчём растворять?


    БСА - в TBS или PBS, лучше с твином



    akimovster /24.07.2008 07:35/
    "Этанол точно работает в 40% концентрации. Всю жизнь так работаю."
    То есть, мембрану предварительно вымачиваем в этаноле, затем уравновешиваем бубером для переноса, содержащим этанол 40%? А почему так много этанола, может стоит 10%? Не будет ли проводимость буфера страдать?



    Ale-x /24.07.2008 12:35/
    (akimovster @ 24.07.2008 07:35)
    Ссылка на исходное сообщение  "Этанол точно работает в 40% концентрации. Всю жизнь так работаю."
    То есть, мембрану предварительно вымачиваем в этаноле, затем уравновешиваем бубером для переноса, содержащим этанол 40%? А почему так много этанола, может стоит 10%? Не будет ли проводимость буфера страдать?


    Ничего не страдает, почему 40% - не знаю, люди добрые подсказали, сам не проверял. Наверное, менделеевка все-таки правильнее разведена. Мембрану вымачиваю в воде и буфером не заморачиваюсь, но думаю, что хуже не будет.



    akimovster /25.07.2008 05:41/
    "Ничего не страдает, почему 40% - не знаю, люди добрые подсказали, сам не проверял. Наверное, менделеевка все-таки правильнее разведена. Мембрану вымачиваю в воде и буфером не заморачиваюсь, но думаю, что хуже не будет."
    А есть разница, какую мембрану использовать? У меня PVDF. Для неё тоже 40% этанол?



    Guest /25.07.2008 08:19/
    20% этанол в буфере для электропереноса тоже вполне отлично работает. А PVDF сначала надо смочить в этаноле (70 - 96%) и далее использовать буфер с этанолом (хоть 20%, хоть 40%).



    akimovster /28.07.2008 07:43/
    "20% этанол в буфере для электропереноса тоже вполне отлично работает. А PVDF сначала надо смочить в этаноле (70 - 96%) и далее использовать буфер с этанолом (хоть 20%, хоть 40%).
    "
    Спасибо Вам!!!



    Pavel2 /12.09.2008 13:12/
    А с каким оборудованием/пластиком вы работаете при инкубации сыворотки и конъюгата? Может есть специальные ванночки?



    guest: ммм /12.09.2008 13:38/
    --А с каким оборудованием/пластиком вы работаете при инкубации сыворотки и конъюгата? Может есть специальные ванночки?

    Есть, но ими никто не пользуется. Хорошо идут квадратные чашки петри, круглые тоже не плохо, коробочки из под китов, коробочки из под канцелярских скрепок и бижутерии, коробочки из под предметных стекл.

    А так качалка любая например от биосана или элми. Так же самодельные качалки из моторчика от КиПА( КСП(потенциометр) КСМ(мост) есть такие промышленные измерительные приборы с самописцем на ЩУПы ставят) вот этот моторчик на него(в смысле наего вал) одевается диск, который служит приводом шатуну, который качает пластину закрепленную грубо говоря как крышка на петлях. У таких качалок есть одно преимущество: они могут работать без остановки месяцами, при температуре от минус 10, до плюс 50.
    А недостатки невозможность регулировать обороты и большой шум(механический редуктор).



    Pavel2 /12.09.2008 14:27/
    -Есть, но ими никто не пользуется. Хорошо идут квадратные чашки петри, круглые тоже не плохо, коробочки из под китов, коробочки из под канцелярских скрепок и бижутерии, коробочки из под предметных стекл.
    Если использовать чашку петри или какую нибудь коробочку, то расход реактивов и сыворотки будет очень большим. Для IgG-иммуноблота необходимо разводить сыворотку 1:2, если мы будем использовать пластик с емкостью даже 5 мл расход сыворотки будет очень большой. А для IgE-иммуноблота разводить сыворотку и конъюгат нужно еще меньше.



    Guest /14.09.2008 12:11/
    Еще можно инкубировать в пакетиках - делать их из файлов для документов (не очень удобно, надо следить за равномерностью покрытия - с опытом приходит). Хороши также 50-мл пробирки (если мембрана узкая). Можно использовать культуральные флаконы (75-ml flask) - они плоские, объем 1 - 2 мл достаточен (при объеме флакона 75 мл).



    guest: ммм /14.09.2008 15:29/
    --Для IgG-иммуноблота необходимо разводить сыворотку 1:2, если мы будем использовать пластик с емкостью даже 5 мл расход сыворотки будет очень большой. А для IgE-иммуноблота разводить сыворотку и конъюгат нужно еще меньше.

    Если б я не знал обстоятельств нашей жизни, я бы посоветовал вам с такими реактивами не работать. А купить или получить нечто более адекватное. Коньюгатов с таким разведением не бывает их просто никто не будет покупать. Сыворотки, конечно разные бывают, но все же. Такую сыворотку можно вобще не разводить, а за-азидить 0.1% азидом и пользоваться(многократно) до тех пор пока не истощится.

    А еще мембрану можно порезать на дорожки из дорожек вырезать нужное место мол веса по маркеру и по пять десять штук в 24 луночном планшете клеточном качать. Или по 2-3 стрипа в фэлконовской 15 мл пробирке на ролере там мл жидкости доложно хватитть на покрытие. Если у вас несколько дорожек с одним антигеном вырезается узкий стрип по мол весу поперек дорожек и в тот же фэлкон.

    Короче голь на выдумки хитра.



    светлана гырылова /07.10.2008 10:53/
    здравствуйте! подскажите пожалуйста, как приготовить самый концентрированный агарозный гель , он мне нужен , чтобы склеить кассету для электрофореза, в процессе иммуноблоттинга. (готовый гель не подходит, я сломала кассету, теперь надо ее склеить,а потом залить в нее новый гель.)



    guest: ммм /07.10.2008 11:59/
    Агароза вас скорее всего не спасет. А что в ы сломали прокладку, заглушку, стекло.

    Высокопроцентную агарозу можно получить только в автоклаве.



    Гость /09.10.2008 08:14/
    я не камеру, а кассету разломала. кассета пластиковая, то есть у меня была кассета с гелем для электрофореза готовая, но ее срок годности вышел, и гель испорчен, я кассету сломала, гель убрала, теперь надо склеить кассету , чтобы залить в нее свежий гель. вроде слышала что склеивают агарозным гелем только вот скольки процентным? и на чем на воде или буфере? пробовала делать 1.5% агар.гель на воде в микроволновке . держит плоховато.



    guest: ммм /09.10.2008 12:53/
    Склейте касету циакриновым клеем хотя бы. А лучше полистиролом(материалом из которого делают культуральный пластик). Он растворяется в толуоле и хлороформе.



    Гость /20.10.2008 11:24/
    спасибо за помощь:)



    Асель Биктасова /01.04.2009 10:30/
    Здравствуйте!!! помогите пожалуйста. Ситуация: проявляем мембраны ТМБ.все было отлично, потом резко мембраны перестали краситься, и весь раствор при этом становился синий, те окраска получилась в растворе. в чем причина? втор ат меняли на новые - не помогает. спасибо



    guest: ммм /01.04.2009 13:59/
    Вы где ТМБ взяли? Просто Тетраметилбензидин на мембрану практтически не садится. Самое простое решение перейти на ДАБ. Разбиратся в фирменных составах обеспечивающих нерастворимость ТМБ на мембране бессмыслено, ибо сотав их производитель умалчивает.

    PS Возможно что-то поменялось в субстратном буфере что мешает ТМБ иммобилизоваться на мембране. Если ничего не менялось, все вопросы к производителю или просто поменять ТМБ на новый.



    Асель Биктасова /02.04.2009 10:52/
    Спасибо. сначала был Хеликон, он красил мембраны, но потом стал выцветать. Заказали новый Био-рад, он вообще никак не хочет фиксироваться... простите, расшифруйте пожалуйста "ДАБ"



    guest: ммм /02.04.2009 11:09/
    ДАБ 3,3' диаминобензидин.



    Raido /18.09.2009 11:15/
    Здравствуйте!
    Помогите, пожалуйста, разобраться!
    1) Работаю с белком 170 кДа (то есть вырезаю полоску по маркеру: от 130 до 250 кДа). Однако перенос на PVDF-мембрану маркера 250 кДа происходит не всегда эффективно (при всех равных условиях: ток 60 мА, перенос - 2 ч, в буфере для переноса 10 % этанол). То есть вчера перенос прошел полностью, а сегодня - приблизительно на 60 % (по интенсивности). Существует ли логическое объяснение наблюдаемому явлению?

    2) При детекции с использованием 2-х антител с пероксидазой хрена столкнулась со следующей проблемой: после проведения 1 минутной реакции с перекисью, люминолом и кумаровой кислотой, без промедления закладываю пленку. При экспонировании 5 сек на пленке наблюдаются все бенды, а при увеличении времени экспонирования до 1 мин - бендов, соответствующих дорожкам в середине, уже нет!! Аналогичная картина и при 5 мин! Полоски физически не деформировались и не смещались. Куда "пропали" бенды и почему так быстро? Проблема в антителах? (Разведение вчерашнее, но сами антитела старенькие - им больше года). Хотя две недели назад, используя эту же систему детекции (и антитела), я получила отличную картинку.
    В общем, мистика какая-то...%)



    Nameless /18.09.2009 17:29/
    Попробуйте 400 мА/2 часа в холодной комнате/холодильнике/на льду.



    Belousoff /19.09.2009 23:54/
    2 Raido по поводу вопроса №2.
    Есть в вестерне такая вещь как выгорание сигнала - с ней вы и столкнулись. Обычно это происходит при значительном избытке первичных или вторичных антител. Собственно то, что после 5-секундной экспозиции у вас уже видны все нужные бэнды, говорит о том, что антител можно брать в разы меньше. Подкорректируйте разведения первичных и вторичных АТ так, чтобы оптимальная картинка получалась после 30-60-секундной экспозиции - в этом случае сигнал будет выгорать гораздо медленнее, и вы сможете спокойно сделать fine-tuning времени экспонирования.



    Guest /20.09.2009 22:00/
    -Существует ли логическое объяснение наблюдаемому явлению?
    Да! Например поменялась площадь фильтровашки(ватмана) в полусухом переносе.
    Или у вас происходит неравномерный перенос по площади элетродов и вы кладете гель в разные места электродов.



    Raido /21.09.2009 05:08/
    Спасибо за помощь. Обязательно учту ваши комментарии в следующий раз.



    Marinka Ts /25.09.2009 15:27/
    Здравствуйте! Помогите, пожалуйста! Скажите, кто-нибудь работал с таким хемилюминецентным субстратом для щелочной фосфатазы, как CDP-star (вместе с Nitroblock-enhancer)? нам его доставили почему-то без инструкции, а в руководстве, поданном на сайте производителя (Applied Biosystems), сказано только, что он 20-кратный и водорастворимый. чем отличаются условия проявки от ECL? можно ли разводить больше, чем в 20 раз (реагента мало, он дорогой)? заранее благодарна за любые советы.



    guest: ммм /25.09.2009 16:44/
    -емилюминецентным субстратом для щелочной фосфатазы,

    Попробуйте почитать про аналог у Роша. (Вообще я сильно подозреваю что АВ впродает или производит по лицензии Роша). ЩФ работает гораздо медленнее ПХ поэтому засвечиваться можно оставлять на ночь.



    Statin /26.09.2009 20:33/
    Вопрос к специалистам по Western-blot, где можно заказать антитела к GAPDH или бета-актину?



    Guest /27.09.2009 18:30/
    -Вопрос к специалистам по Western-blot, где можно заказать антитела к GAPDH или бета-актину?

    Ваш вопрос не имеет отношения к блоту и к специалистам

    Краткий ответ: в магазине.



    angel eyes The bad /27.09.2009 19:06/
    Название магазина : Abcam



    Statin /27.09.2009 19:18/
    "Название магазина : Abcam"
    Если можно ссылочку, заранее спасибо.



    lna /05.10.2009 14:07/
    подскажите пожалуйста, где искать подвох!
    на SDS-геле не вижу классического бромфенолового синего фронта. напротив, краска идет в каждой дорожке отдельным бэндом, много выше предполагаемого фронта. маркер (prestained) разделяется как на картинке производителя.. единстевнное, есьб ощущение, что форез идет бытсрее, чем надо.
    это все сразу выкинуть или помучаться?



    guest: ммм /05.10.2009 15:08/
    Возможно это не БФС. Возможно что-то напутано с рН( проверте по индикаторной бамажке), но если маркер красив, то скорее всего краска-свидетель не адекватна.



    akimovster /06.10.2009 05:20/
    Уважаемые коллеги! У меня несколько вопросов:
    1.Можно ли PBS в используемых растворах заменить на воду mQ? Если да, то в каких?
    2.После забивки, промывки RB, отмывки в спирте и высушивания, можно ли хранить мембрану, если да, то какое время и при каких условиях?
    Спасибо! mol.gif



    guest: ммм /06.10.2009 08:44/
    -1.Можно ли PBS в используемых растворах заменить на воду mQ? Если да, то в каких?

    Можно, в тех, в которых это не скажется на качестве.

    -2.После забивки, промывки RB, отмывки в спирте и высушивания, можно ли хранить мембрану, если да, то какое время и при каких условиях?

    Можно. При комнатной температуре между двух фильтровашек под прессом. До тех пор пока там еще, что-то можно окрасить.

    Иван! Каков вопрос таков ответ. Если хотите получить что-то вразумительное, пишите вразумительно: используйте меньше сокращений и описывайте подробнее и конкретнее интересующую вас ситуацию.



    akimovster /07.10.2009 11:40/
    - "Иван! Каков вопрос таков ответ. Если хотите получить что-то вразумительное, пишите вразумительно: используйте меньше сокращений и описывайте подробнее и конкретнее интересующую вас ситуацию."

    - Хорошо. Ситуация такая: хочу секономить PBS.
    1.Можно ли после переноса хранить мембрану несколько дней не в растворе PBS, а в автоклавированной воде mQ?
    2.Можно ли для промывки использовать 0.05% tween-20 / в воде?
    3.Можно ли антитела разводить в 0.05% tween-20 / в воде?

    Не повлияет ли это деструктивно на белки, антитела и мембрану?
    Спасибо!



    angel eyes The bad /07.10.2009 11:54/
    "Ситуация такая: хочу секономить ПБС"
    Нашли на чем економить Ну лень делать ПБС сделайте ТБС 50мМ трис 150мМ соли 7.5
    Мембрану после переноса можно хратить просто завернув в саран и на +4.
    Про остальное я не експериментировал, а то економия выдет дополнительными рас ходами



    akimovster /06.11.2009 07:05/
    (guest: ммм @ 14.07.2008 19:51)
    Ссылка на исходное сообщение  --БСА в какой коцентрации? и Вчём растворять?
    А молоко  в чем растворяете?

    0.5% БСА в PBS, молоко - тоже...



    akimovster /26.11.2009 11:19/
    Товарищи! Можно ли замораживать водный раствор (в PBS)БСА? Спасибо!



    guest: ммм /26.11.2009 16:23/
    -0.5% БСА в PBS, молоко - тоже...
    Угу! Тоже! 5% молоко можно даже 10%.

    -Товарищи! Можно ли замораживать водный раствор (в PBS)БСА? Спасибо!
    Можно, можно если вы его для забивки используете, но лучше сделать сток 10%, он так на морозе лучше хранится.



    smmuscle /04.12.2009 03:37/
    (guest: ммм @ 26.11.2009 17:23)
    Ссылка на исходное сообщение  -0.5% БСА в-Товарищи! Можно ли замораживать водный раствор (в PBS)БСА? Спасибо!
    Можно, можно если вы его для забивки используете, но лучше сделать сток 10%, он так на морозе лучше хранится.

    И лучше открутить после разморозки, чтобы удалить аггрегировавший БСА (15000g)



    plotter /20.01.2010 16:55/
    Для проявки в ДАБе дали рекомендацию добавить 5мМ хлорида кобальта. А зачем его туда добавлять? И можно ли его заменить например хлоридом стронция?
    В принципе работает и без него, но просто любопытно стало...



    guest: ммм /20.01.2010 17:18/
    Нельзя .

    И Вот почему кобальт образует окрашенные комплексные соединения с продуктом окисления ДАБ в результате повышается глубина окраски и чувствительность. А стронций а) бесцветный, б) Комплексы если и образует, то крайне непрочные.

    Кроме кобальта еще используют соли Никеля.



    plotter /20.01.2010 17:21/
    Благодарствую.



    Крыска /08.02.2010 12:28/
    Вопрос наверно глупый, т.к. основан на домыслах, но все-таки
    Можно ли при использовании ПВДФ мембраны пользоваться трансфер буффером на Этаноле или в этом случае только метанол???



    smmuscle /08.02.2010 13:35/
    Можно и на этаноле и на метаноле!



    Крыска /08.02.2010 14:23/
    Т.е. можно вообще без метанола, и вымачивать и переносить в этаноле?



    smmuscle /08.02.2010 14:43/
    Да, можно во всех операциях заменить метанол на этанол. Просто у буржуинов метанол дешевле, вот они и пишут в протоколах везде метанол.



    svetodiodovna /14.02.2010 23:00/
    Уважаемые коллеги, подскажите, пожалуйста. У меня сильно положительный белок (pI=11,25) и он совсем не хочет переноситься на PVDF мембрану. Остальные белки:отрицательный контроль и маркеры переносятся. Может, кто подскажет, что добавить в буфер для переноса или в sample buff, чтобы поспособствовать переносу. Буфер для переноса использую трис-глициновый с 10%этанола.



    guest: ммм /15.02.2010 00:44/
    -и он совсем не хочет переноситься на PVDF мембрану.
    1.Как вы это установили?
    2. Какова масса белка? И процентность геля?
    -что добавить в буфер для переноса или в sample buff
    Может быть вам мембрану с другой стороны положить?

    Добавьте 0.02% SDS в буфер для переноса. Но боюсь что причина не в том что он не переносится?



    protein /15.02.2010 02:06/
    а как вы определили что он не переносится? может проблема в антителах?



    svetodiodovna /15.02.2010 14:01/
    Антитела проверялись элайзой.
    Мембрану после переноса крашу ponceau red, моего белка нет, все остальное прокрашивается. Акриламидный гель после переноса крашу кумасси, мой белок четко виден, остальные не прокрашиваются (отрицательный контроль, маркеры)

    Масса белка 22кДа, процентность акриламидного геля - 12%.
    В буфер для переноса пробовала добавлять SDS до концентрации 0,2%. Не помогло.

    Хочу попробовать положить мембрану с двух сторон, тогда мой белок и маркеры с отрицательным контролем будут на разных мембранах.



    smmuscle /15.02.2010 15:28/
    Может, попробовать буфер для переноса приготовить с более щелочным рН, чем pI белка, или уж тогда действительно в другую сторону переносить без SDS confused.gif smile.gif



    smmuscle /15.02.2010 15:35/
    а вообще, странно confused.gif , если при электрофорезе он входит в гель, то почему же он не переносится тогда. Или у Вас форез какой-то экзотческий, не по Лэммли?



    guest: ммм /15.02.2010 17:11/
    -Мембрану после переноса крашу ponceau red, моего белка нет.

    Это ничего не значит, у понсо очень низкая чувствительность, раз в 10 меньше чем у кумаси. Те может оказаться что то что видит кумаси, понсо просто не видит.

    -Масса белка 22кДа, процентность акриламидного геля - 12%.
    Должен вылетать на раз.

    -В буфер для переноса пробовала добавлять SDS до концентрации 0,2%. Не помогло.

    Так много SDS не имеет смысла(даже плохо) у вас белки начнут пролетать мимо мембраны в такой процентности SDS. Не надо грузить SDS больше 0.05%. Если хотите для маленького белка(22кДа) добавьте спирта до 20% будет получше.

    1) Покрасьте белок антителами на мембране или кумасей(если вам не жалко блота, от кумаси потом практически не отмыться.) Просто что бы убедится, что все так плохо как вы думаете. Я думаю иначе.

    2) Добавте этанола в буфер и немного SDS и увеличьте ток или время переноса. Результаты должны улучшиться.



    svetodiodovna /15.02.2010 21:40/
    (smmuscle @ 15.02.2010 16:35)
    Ссылка на исходное сообщение  а вообще, странно confused.gif , если при электрофорезе он входит в гель, то почему же он не переносится тогда. Или у Вас форез какой-то экзотческий, не по Лэммли?



    Форез стандартный, если не ошибаюсь верхний и нижний гели содержат по 0,1%SDS, а running buffer - 0,4% SDS. Видимо, такого количества SDS хватает, чтобы белок приобрел отрицательный заряд и двигался в геле. Поэтому, в буфер для переноса я добавила SDS 0,2% (встречала в инете от 0,01 до 0,1%. Я добавила больше, чтобы наверняка, но как-то не помогло)



    svetodiodovna /15.02.2010 21:50/
    (guest: ммм @ 15.02.2010 18:11)
    Ссылка на исходное сообщение  -Мембрану после переноса крашу ponceau red, моего белка нет.

    Это ничего не значит, у понсо очень низкая чувствительность, раз в 10 меньше чем у кумаси. Те может оказаться что то что видит кумаси, понсо просто не видит.


    Мембрану красила амидовым черным, вроде, достаточно чувствительный краситель.


    (guest: ммм @ 15.02.2010 18:11)
    Ссылка на исходное сообщение 
    Так много SDS не имеет смысла(даже плохо) у вас белки начнут пролетать мимо мембраны в такой процентности SDS. Не надо грузить SDS больше 0.05%. Если хотите для маленького белка(22кДа) добавьте спирта до 20% будет получше.

    Спасибо. Попробую такой вариант тоже.


    (guest: ммм @ 15.02.2010 18:11)
    Ссылка на исходное сообщение
    1) Покрасьте белок антителами на мембране или кумасей(если вам не жалко блота, от кумаси потом практически не отмыться.) Просто что бы убедится, что все так плохо как вы думаете. Я думаю иначе.

    Мембрану антителами проявляла. ECL работает точно.



    svetodiodovna /15.02.2010 21:53/
    (guest: ммм @ 15.02.2010 18:11)
    Ссылка на исходное сообщение   увеличьте ток или время переноса. Результаты должны улучшиться.


    Гнала при 30мА ночь при +4 и 250-300мА в течение 2 часов. Этого достаточно или еще увеличить силу тока?



    Daemonarchestratygos /15.02.2010 22:30/
    (svetodiodovna)
    Ссылка на исходное сообщение У меня сильно положительный белок (pI=11,25) и он совсем не хочет переноситься на PVDF мембрану. Масса белка 22кДа, процентность акриламидного геля - 12%.


    1) Есть такие маленькие (10-22 кДа), сильно оснОвные (pI 10.5-11) ядерные белки - гистоны. И с ними такой проблемы почему-то не возникает. confused.gif
    2) А чем нитроцеллюлоза хуже ПВДФ? confused.gif



    svetodiodovna /16.02.2010 10:43/
    (Daemonarchestratygos @ 15.02.2010 23:30)
    Ссылка на исходное сообщение  
    2) А чем нитроцеллюлоза хуже ПВДФ? confused.gif


    По-моему, эти мембраны ничем принципиальным не отличаются (или я ошибаюсь?)
    Поэтому я работала над белком: подщелочила его до рН9 (вместо 4,5 в буфере Е), sample buf использовала с 9М мочевиной, добавила еще больше сдс в sample buf, кипятила,добавила сдс в буфер для переноса. Всеми этими манипуляциями я пыталась сдвинуть заряд белка в более отрицательную сторону и поспособствовать переносу.
    Но если вы считаете, что нитроцеллюлоза поможет, я попробую.



    Мне в принципе интересно, как работают с положительными белками? Я думала, что есть модификации классических методик. Или никаких особых манипуляций над ними не производят,а хватает обычного содержания сдс для придания отрицательного заряда?
    Видимо, буду пробовать разные варианты, которые были предложены выше, и постараюсь победить этот белок упорством.



    smmuscle /16.02.2010 11:26/
    ПВДФ более гидрофобная, поэтому больше подходит для некоторых белков, они к ней лучше липнут. Только к ней, заразе, бывает, антитела тоже неспецифично липнут, поэтому фон иногда получается выше, чем на нитроцеллюлозе.



    guest: ммм /16.02.2010 16:46/
    -Мембрану антителами проявляла. ECL работает точно.
    Как то странно вы отвечаете белок-то ваш покрасился или нет. Работоспособность ЕСL можно проверить вообще без блота.

    -Гнала при 30мА ночь при +4 и 250-300мА в течение 2 часов. Этого достаточно или еще увеличить силу тока?

    1) Совершенно бессмысленно это обсуждать без указания других параметров переноса

    2) К тому же если сказано увеличить, то надо увеличивать просто, что бы проверить как это скажется на результате. Не существует никакой теории, которая предсказывает результат переноса по его параметрам. Существуют только эмпирические рекомендации.

    А антитела то у вас работают вы не пробовали просто дот красить.

    - подщелочила его до рН9 (вместо 4,5 в буфере Е)
    Это еще что такое кислые буфера кодировки буквенные, непонятно,

    -sample buf использовала с 9М мочевиной, добавила еще больше сдс в sample buf

    Странно, у вас что белок сильно в осадке, мембранный? Зачем мочевина в сэмпле? Щелочной белок с pI больше 9 в 9М мочевине, не зависимо от количества SDS в пробе, рискует вообще вылететь из геля. Непонятно как он у вас в гель входит, может это и не он вовсе.



    PerkinElmer /26.10.2010 13:52/
    Уважаемые коллеги!

    Компания “Pribori Oy” предлагает большой выбор реагентов для проведения western blotting analysis (вестерн-блотинг анализа) производства американской фирмы “Perkin Elmer” для научных исследований, медицины и биотехнологии. Поставка продукции выполняется точно в срок со склада и под заказ. Высокое качество при умеренной цене!

    С уважением, компания "Pribori Oy"



    biooil /11.03.2011 22:30/
    Подскажите может ли негативно повлиять на разгон белков в ПААГ добление поливинилпирролидона в лизирующий буффер?



    guest: ммм /11.03.2011 23:28/
    -- Подскажите может ли негативно повлиять на разгон белков в ПААГ добление поливинилпирролидона в лизирующий буффер?

    Не должОн.



    biooil /14.03.2011 18:10/
    Нужен более конкретный ответ, т.к. очень мало материала...



    guest: ммм /14.03.2011 18:30/
    маркер прогоните с ПВП. Будет конкретный ответ.



    DK. /02.07.2011 23:23/
    Досточтимые коллеги, помогите, пожалуйста, "догнать прогресс" smile.gif Раньше ставил SDS-PAGE регулярно,когда работал с высокомолекулярными мембранными белками. Тогда заливал гели, в том числе градиентные, в основном сам (иногдa Bio-Rad) - а блоттинги проявлял ECL(Pierce), но в последний раз пришлось заниматься этим лет семь назад.
    Сейчас опять возникла необходимость в блоттинге для другой задачи - но за это время появилось множество фирм, поставляющих готовые полиакриламидные гели для белкового SDS-фореза, да и с ECL реагентами большой выбор confused.gif . Памятуя, что но "умный учится на чужих ошибках, а дурак на своих" smile.gif , решил спросить вас - наверняка здесь многое перепробовано -из вашего опыта, готовые гели каких производителей наиболее достойны внимания по соотношению цена/качество?( это прежде всего экономия времени - или они еще и, действительно, лучше самодельных?)
    Тот же вопрос по ECL: цена/чувствительность, поскольку искомые белки ( в диапозоне 25-50 кДа), предположительно, слабо экспрессированы.
    Что посоветуете? - заказываться будет в Европе.



    Tom1 /03.07.2011 03:38/
    1. для мини форезов так и остался "Био в рад" так выпускают и другие компашки, но обычно гели заточены под собственные камеры и с собственными буферами на классическим трис-глицином.
    Что касаемо ЕСЛ то пользую 2 один " домашний" по прописи аналогичной выложенной тут в разделе методы люминол-кумариковая кислота и "фемто" от "Шивера" на случай совсем уж слабенького сигнала.
    Все енто касаемо реактивов в юсах, в европах чесно скажу не ведам гы-гы)))



    DK. /03.07.2011 11:08/
    (Tom1 @ 03.07.2011 02:38)
    Все енто касаемо реактивов в юсах, в европах чесно скажу не ведам гы-гы)))
    - они все и по европам распластались уже smile.gif .



    DK. /03.07.2011 11:56/
    (Tom1 @ 03.07.2011 02:38)
    Ссылка на исходное сообщение  1. для мини форезов так и остался "Био в рад"  так выпускают и другие компашки, но обычно гели заточены под собственные камеры и с собственными буферами на классическим трис-глицином.
    - да, буферы "компанейские", pH в геле вроде бы пониже, чем в трис-глицине (хотя для меня это вряд ли критично) бежит быстрее... но этих фирм множество сейчас: пока рассматривал Bio-Rad, Invitrogen и Lonza, наверняка это "не полный список" - и не хочется тратить денюжку, да и время, на выяснение - кто лучше. Тем более, не исключено, что "из одной бочки льют"... smile.gif



    Tom1 /03.07.2011 19:56/
    пробовал лично все из выше перечисленных самое плохое впечатление от инвитро"...
    Лонза и врад примерно одинаковы, но лонза в юсах подороже будет. гы-гы))))



    DK. /04.07.2011 00:28/
    (Tom1 @ 03.07.2011 18:56)
    Ссылка на исходное сообщение  пробовал лично все из выше перечисленных самое плохое впечатление от инвитро"...
    - и именно инвитро у нас самый дорогой из всех трех smile.gif .
    Tom1, а Q-dot вместо ЕСL, случаем, не пробовали? По описанию выглядит заманчиво, я попробовал - свечение есть,где надо, но чтобы добиться наилучшего результата, УФ-освещение должно быть сверху ( как у старых камер, где ТСХ смотрели smile.gif ), и система регистрации требует изменений -вот и раздумываю, стоит ли связываться, не слишком ли я резво "догоняю прогресс" smile.gif



    Tom1 /04.07.2011 01:26/
    нет сим "зверем" я не пользовался. Не возникало потребности.....



    DK. /04.07.2011 09:16/
    (Tom1 @ 04.07.2011 00:26)
    Ссылка на исходное сообщение  нет сим "зверем" я не пользовался.  Не возникало потребности.....
    - у меня скорее "возникло любопытство", когда предложили "безвозмездно, т.е. задаром" попробовать: свечение яркое, не выгорает долго. Но та картинка, которую получил на УФ-иллюминаторе для этидиумбромидных гелей, была не лучше ECL. Дальше надо было усовершенствовать регистирирующую технику - но изменился проект, и я так и остался в неведении frown.gif - стоит ли игра свеч.



    DK. /20.10.2011 21:24/
    После блоттинга и отмывки от Понсе блоты можно хранить довольно долго - а можно ли хранить (несколько дней) после блокировки молоком 5%? Как лучше -отмыть и оставить в "полусыром виде" в холодильнике? Или все-таки в том же блокирующем растворе?



    guest: ммм /21.10.2011 04:39/
    Можно! Можно даже высушить и через несколько лет размочить снова. Но только не со всеми белками это проходит. Несколько дней можно хранить под водой с азидом и ЭДТА.



    Tom1 /21.10.2011 18:28/
    Предпочитаю хранить 2 способами либо завернутым в саран мокрый хранится без особых проблем до 2 месяцев. Либо сушу и храню между фильтровашками до года.
    однако в обоих случаях предпочитаю делать это после блокировки, лутше БСА.



    DK. /22.10.2011 12:44/
    Cпасибо! - еще вопрос вдогонку: я, чтобы соотнести ECL и исходный блот, по старнике делаю еще и длительную экспозицию - когда края нитроцеллюлезного блота хорошо видны (правда, все остальное гипер...). Как проще маркировать углы блота,чтобы видеть на пленке?- не дырявить же... smile.gif Биотинилированные маркеры не совсем хороши - трудно угадать в каждом случае, какая экспозиция понадобится. Просто на углы наносить пробовал конъюгат с пероксидазой, после блоттинга - неаккуратное зрелище на финише. Кажется, есть какой-то люминесцентный карандаш - но "живьем" его не видел. Какие есть варианты?



    guest: ммм /22.10.2011 18:21/
    мембрану когда кладете на пленку при красном свете обычном маркером углы отмечайте. все



    DK. /22.10.2011 21:15/
    (guest: ммм @ 22.10.2011 17:21)
    Ссылка на исходное сообщение  мембрану когда кладете на пленку при красном свете обычном маркером углы отмечайте. все
    - А маркер (понятно, не водорастворимый), не слезает при проявке?у нас в Ин-те для проявки пленок используется кодаковская машина: попробую - надеюсь, не перепачкаю машину smile.gif



    DK. /22.10.2011 21:41/
    Ну, понятно, насчет "испачканной машины" - шутка, но все-таки удобнее бы иметь что-то люминсцирующее в углах самого блота - не собьется при закрывании кассеты и т.п. Хотя маркер - тоже вариант.



    guest: ммм /23.10.2011 08:24/
    Господи! Из-за одной пленки машину гонять! Смех! Буржуи они и есть.
    Да! Обычный маркер для надписей на стекле и пластике. Не слезет

    -не собьется при закрывании кассеты и т.п.
    Один кусочек малярной липкой бумажной ленты и у вас уже ничего не собьется.



    DK. /23.10.2011 10:56/
    (guest: ммм @ 23.10.2011 07:24)
    Ссылка на исходное сообщение  Господи! Из-за одной пленки машину гонять! Смех! Буржуи они и есть.
    - обижаете smile.gif , зачем же из-за одной! одной пленкой и мне-то ограничиться не удается, а там гоняет весь Институт. Буржуи и подсчитали, ч то технологичнее и дешевле выделить одну фотокомнату и поставить одну машину, чем каждой из дюжины лаботаторий выделять площадь на свою фотокомнату и заводить свое, хоть и простенькое, но свое, оборудование и реагенты. Так что машина трудится, "не покладая мотора", до позднего вечера - другое дело, что туда поздно вечером только и прорвешься smile.gif ...

    Сейчас подумываем- не лучше ли купить люминесцентный "имидж-анализатор", чтобы обходиться без пленки и сразу, если нужно, обсчитывать интенсивности. Правда, доверия у меня к этим интенсивностям... но как "картинка", видимо, не хуже пленки. Есть какая-то "экспертная оценка" таких камер?



    guest: ммм /23.10.2011 12:24/
    У нас такая колымага стоит, только старая(лет 5-6) они устаревают за 3 года (цифровой век, мля). Ей мало кто пользуется, ибо она тоже, как ваша проявочная машина, коллективная, а людям удобнее у себя под боком пленку проявить. Работает она нормально, единственный к ней претензий - разрешение каку веб-камеры, при увеличении - квадратики лезут. Но современные такие машинки у них с разрешением получше.



    Serpent /24.10.2011 17:20/
    У нас на кампусе тоже таких машин понаставили, по 1 на этаж - BioRad ChemiDoc XRS+. ИМХО удобно, да и подходит для всего - хошь блоты, хошь кумасси всякие, хошь вообще агарозные гели туда суй... Я лично теперь в темную комнату на старый фильм процессор ходить перестал, но отдельные закоренелые ретрограды еще проявляют блоты по старинке.



    Tom1 /24.10.2011 17:42/
    Если уж ДК так претит пользоватся чернилами пусть купить у Стратагена флуоресцентную ленту.....



    DK. /24.10.2011 21:49/
    (Serpent @ 24.10.2011 16:20)
    Ссылка на исходное сообщение  У нас на кампусе тоже таких машин понаставили, по 1 на этаж - BioRad ChemiDoc XRS+. ИМХО удобно, да и подходит для всего - хошь блоты, хошь кумасси всякие, хошь вообще агарозные гели туда суй...
    -у нас собираются покупать LAS-4010 (GE Life Sciences), вроде практически то же самое. Жаль, эпи- УФ еще нет там, для флюоресценции на блотах или ТСХ: но это уже другой класс прибора, охлаждения требует.



    DK. /24.10.2011 22:05/
    (Tom1 @ 24.10.2011 16:42)
    Ссылка на исходное сообщение  Если уж ДК так претит пользоватся чернилами пусть купить у Стратагена  флуоресцентную ленту.....
    -а что с флюоресцентной лентой делать - ее же еще и возбуждать confused.gif ? Наверно, люминесцентной?
    Не, чернилами не претит - просто если писать чернилами, то хочется ближе к "первоисточнику: НЦ мембране." Например, наносят в углы точку "Night Light" - такая суспензия в сосуде с носиком, чтобы разрисовывать всякое разное (вроде стен и потолков) люминесцирующими изображениями. Вот и вспомнил "слухи", что существует что-то типа такого карандаша - для блотов.



    DK. /10.11.2011 10:36/
    Знает или хоть догадывается кто-нибудь, что за "зверь" NuPAGE antioxidant от Invitrogen? - который нужно вносить не только в образец, но и в верхний буфер. По "аромату" не ДТТ и не меркаптоэтанол...



    Serpent /10.11.2011 17:37/
    (DK. @ 10.11.2011 08:36)
    Ссылка на исходное сообщение  Знает или хоть догадывается кто-нибудь, что за "зверь" NuPAGE antioxidant  от Invitrogen? - который нужно вносить не только в образец, но и в верхний буфер. По "аромату" не ДТТ и не меркаптоэтанол...


    Может, TCEP?



    Tom1 /10.11.2011 18:35/
    Скорее всего.



    bee1 /10.11.2011 20:17/
    bee1 /10.11.2011 20:21/
    попробовал горизонтальные кассеты Генерального Електрика для вестерна smile.gif
    работают прекрасно , но "подсаживают" источник питания smile.gif
    160 в0лт нужно поболее ампер smile.gif



    DK. /11.11.2011 00:20/
    (Serpent @ 10.11.2011 16:37)
    Ссылка на исходное сообщение  Может, TCEP?
    - да вроде если мне память и нюх не изменяют, ТСЕР практически без запаха, а этот... денатуратом, что ли, попахивает.
    Пишут,что он мигрирует с белками - но зачем-то его добавляют и в верхний буфер, а не только в сампл - буфер. Несовместим с"химией" других гелей, да еще " proprietary".
    Правда, Кайяджен свой раствор бетаина тоже так загадочно назвал "раствор Ку" - может, и здесь такой же proprietary...



    bee1 /11.11.2011 02:53/
    (DK. @ 11.11.2011 01:20)
    Ссылка на исходное сообщение  - да вроде  если мне память и нюх не изменяют, ТСЕР практически  без запаха, а этот... денатуратом, что ли, попахивает.
    Пишут,что он мигрирует с белками - но зачем-то его добавляют и в верхний буфер, а не только в сампл - буфер. Несовместим с"химией" других гелей, да еще  " проприетары".
    Правда, Кайяджен свой раствор бетаина тоже так загадочно назвал "раствор Ку" - может, и здесь такой же проприетары...

    в кассетах Генерального Електрикса тока был преран - 15 минут - ты что - до сих пор вертикали ставишь smile.gif ?



    DK. /11.11.2011 09:58/
    (bee1 @ 11.11.2011 01:53)
    Ссылка на исходное сообщение  в кассетах Генерального Електрикса тока был преран - 15 минут - ты что - до сих пор вертикали ставишь smile.gif  ?
    -ага, от добра добра не ищут. Вряд ли в в горизонтали ТСЕР пахнет иначе smile.gif . Или лучше совместим с "химией". Мой вопрос, что у них нам за зверь confused.gif , а не по какому - вертикальному или горизонтальному треку ему бегать.
    (bee1 @ 10.11.2011 19:21)
    Ссылка на исходное сообщение  попробовал горизонтальные кассеты Генерального Електрика для вестерна smile.gif
    работают прекрасно , но "подсаживают" источник питания smile.gif
    160 в0лт нужно поболее ампер smile.gif
    - ну и что: у Био-рада 200 вольт полчаса, току все равно, горизонтально или как smile.gif



    DK. /15.11.2011 00:17/
    Люминесцирующая суспензия "Night Light", дйствительно, оказалась удобным и недорогим вариантом для маркировки углов блота. И как другой вариант еще понравилось наносить сразу после переноса в углы блота любые "не относящиеся к делу" антитела, конъюгированные с пероксидазой - никакой сдвиг тогда не поблема.



    DK. /23.11.2011 21:57/
    Есть здесь у нас "черный лист" компаний, у кого не стоит покупать первичные антитела? давненько не приходилось блоттинг ставить, память "девичья", да и качество работы компаний со временем меняется - а сейчас обнаружилось, что от Санта Круз одно моноклональное антитело работает очень прилично, а другое, к тому же самому антигену, но другому эритопу не узнает положительный контроль не только в 5% молоке (как рекомендовано производителем), но и просто в Т-ТВS с всего-то 0.05% твином. Хотя ожидался бы огромный фон - но его нет, и на том спасибо smile.gif .
    А вот все три антитела от ENZO работают с первой же попытки- никакой оптимизации не потребовалось. Хорошо бы знать текущее положение дел, кто "не совсем добросовестные производители"... frown.gif или тем более совсем не.



    bee1 /23.11.2011 22:48/
    (DK. @ 23.11.2011 22:57)
    Ссылка на исходное сообщение  Есть здесь у нас "черный лист" компаний, у кого не стоит покупать первичные антитела? давненько не приходилось блоттинг ставить, память "девичья", да и качество работы компаний со временем меняется - а сейчас обнаружилось, что от Санта Круз одно  моноклональное антитело работает очень прилично, а другое, к тому же самому антигену, но другому эритопу не узнает положительный контроль не только в 5% молоке (как рекомендовано производителем), но и просто в Т-ТВС с всего-то 0.05% твином. Хотя ожидался бы огромный фон - но его нет, и на том спасибо smile.gif .
    А вот все три антитела от ЕНЗО работают с первой же попытки- никакой оптимизации не потребовалось. Хорошо бы знать текущее положение дел, кто "не совсем добросовестные производители"... frown.gif  или тем более совсем не.


    мнеб твои проблемы smile.gif попробуй найди антитела
    для хроматин иммуноприципитации (ЧиП) smile.gif



    bee1 /23.11.2011 22:55/
    (DK. @ 23.11.2011 22:57)
    Ссылка на исходное сообщение  Есть здесь у нас "черный лист" компаний, у кого не стоит покупать первичные антитела? давненько не приходилось блоттинг ставить, память "девичья", да и качество работы компаний со временем меняется - а сейчас обнаружилось, что от Санта Круз одно  моноклональное антитело работает очень прилично, а другое, к тому же самому антигену, но другому эритопу не узнает положительный контроль не только в 5% молоке (как рекомендовано производителем), но и просто в Т-ТВС с всего-то 0.05% твином. Хотя ожидался бы огромный фон - но его нет, и на том спасибо smile.gif .
    А вот все три антитела от ЕНЗО работают с первой же попытки- никакой оптимизации не потребовалось. Хорошо бы знать текущее положение дел, кто "не совсем добросовестные производители"... frown.gif  или тем более совсем не.


    антитела , которые не работают на вестерне - это вроде байки едак 20-летней давности smile.gif



    DK. /24.11.2011 10:18/
    (bee1 @ 23.11.2011 21:55)
    Ссылка на исходное сообщение  антитела , которые не работают на вестерне - это вроде байки едак 20-летней давности  smile.gif
    - если "вроде", то "таки да". И что за страсть у насекомого -во всех темах "отметиться", воображая себя четвероногим на выгуле... mad.gif
    Что до иммунопреципитации хроматина - антитела anti- acetyl-H3 и anti- acetyl-H4 от Upstate Biotechnology работали у нас вполне достойно, и точно менее 20 лет тому назад tongue.gif .Можно внести в положительный список - если они все еще существуют. Сейчас ActiveMotif эту грядку окучивает.



    dariakha /03.03.2012 11:52/
    Уважаемые коллеги, подскажите, пожалуйста, рентгеновской пленкой каких фирм можно пользоваться для детекции хемилюминесценции после проявления блота ECL Plus (Amersham). Обязательно ли покупать Hyperfilm ECL (Amersham), или рентгеновские пленки других фирм дают сравнимые результаты? Поделитесь, пожалуйста, опытом. Заранее спасибо!



    guest: ммм /05.03.2012 15:42/
    Мы не пользуемся ECL+. А в других случаях подходит любая высокочувствительная(медицинская) рентген пленка с чувствительность 700-1500р-1 Кодак(Дюпон), Сеа(АГФА) РЕНТ(Восточная германия) и Даже ТАСМА и СВЕМА



    dariakha /11.03.2012 11:51/
    (guest: ммм @ 05.03.2012 16:42)
    Ссылка на исходное сообщение  Мы не пользуемся ECL+. А в других случаях подходит любая высокочувствительная(медицинская) рентген пленка с чувствительность 700-1500р-1 Кодак(Дюпон), Сеа(АГФА) РЕНТ(Восточная германия) и Даже ТАСМА и СВЕМА

    Большое спасибо! А чем вы проявляете блот?



    guest: ммм /11.03.2012 12:53/
    --Большое спасибо! А чем вы проявляете блот?

    Люминол/пара-кумаровая кислота - это обычный ECL.



    dariakha /11.03.2012 16:54/
    (guest: ммм @ 11.03.2012 13:53)
    Ссылка на исходное сообщение  --Большое спасибо! А чем вы проявляете блот?

    Люминол/пара-кумаровая кислота - это обычный ECL.

    Еще раз спасибо! А у меня еще вопрос: не подскажете пропись проявителя и закрепителя для пленки? Или посоветуете, какие купить готовые? Я нашла несколько прописей проявителя и закрепителя, но не знаю, какие лучше использовать - собираюсь использовать ЕСL кит в первый раз.



    guest: ммм /11.03.2012 21:06/
    Купите любой готовый проявитель и фиксаж от кодака для рентген пленки.
    Для проявителя нужен метол, гидрохинон, сульфит натрия, сода кальценированная, бромистый калий. У вас все это есть в наличии? Если вам знакомы прописи проявителя Д19 или Р-2 то они оба подходят, фиксаж может быть любой.



    dariakha /13.03.2012 17:48/
    (guest: ммм @ 11.03.2012 22:06)
    Ссылка на исходное сообщение  Купите любой готовый проявитель и фиксаж от кодака для рентген пленки.
    Для проявителя нужен метол, гидрохинон, сульфит натрия, сода кальценированная, бромистый калий. У вас все это есть в наличии? Если вам знакомы прописи проявителя Д19 или Р-2 то они оба подходят, фиксаж может быть любой.

    Спасибо!



    Umo4ka /15.03.2012 19:56/
    Господа! Мы с коллегой поставили блот, проявили ECL+, получили банды. Черные, слабоватые, но жить можно. Где ждали и еще кое-где, но вполне объяснимо. И белые. Там где должны были быть черные. Ну или не совсем там (мы ищем сразу несколько гистонов в смеси). И фон, довольно сильный. Я считаю, что надо пожиже АК развесть (возможно оба, но уж первичный - наверняка). Коллега считает наоборот, нужно повышать концентрацию. Пожалуйста смейтесь или не смейтесь, но рассудите!



    guest: ммм /16.03.2012 07:25/
    АК - это автомат Калашникова? smile.gif

    С белыми бандами у комдива Чапаева разговор короткий.



    Umo4ka /16.03.2012 10:45/
    Смеяться, право, не грешно...
    АК - это антитело ( Antikörper). Банд - это полоска такая на мембране, там где белок сидит двумя антителами распознанный.... tongue.gif



    chambermaid /03.05.2012 14:55/
    Здравствуйте! Помогите советом! Ставлю блот - все идет нормально, но когда проявляю у меня один засвет на пленках((( Я уже коньюгат и сыворотку титровала, хорошо отмывала мембрану, но все же пленки у меня получаются черными. В чем может быть дело??? Спасибо.



    guest: ммм /03.05.2012 18:46/
    1)Вы пользуетесь засвеченной пленкой. Или к примеру ваш фиксаж не работает.
    2)Ваши антитела первые или вторые не видят антигена(возможно что его и нет на самом деле)
    3) высокий уровень неспецифики.



    marys /31.07.2013 11:04/
    Подскажите, пожалуйста, кто-нибудь использовал лимонную кислоту после окраски ТМБ (для стабилизации окраски)? если да, то в какой концентрации и на какое время?



    guest: ммм /31.07.2013 12:12/
    --Подскажите, пожалуйста, кто-нибудь использовал лимонную кислоту после окраски ТМБ (для стабилизации окраски)? если да, то в какой концентрации и на какое время?

    А вы не путаете ИФА и Western? Боюсь лимонка навредить может. Может ссылку дадите откуда дрова. Нафиг ее стабилизировать под сканер и все дела. Неделю она точно держится.



    Atfatra /24.04.2014 01:14/
    Всем доброго времени суток. Перед вопрос поискал на форуме, не нашел, поэтому пишу здесь.


    Подскажите, кто как обрабатывает статистически изображения блотов. Интересует именно момент "получения циферки". Дальше все понятно. Я пытаюсь делать это в ImageJ, но у меня возникают немалые сложности.

    1) Самое неприятное, я не могу добиться статистически значимых результатов на блоте, который "глазами" кажется явно имеет различия в количестве белка на дорожке. Сразу оговорюсь, разница все-таки не в десятки раз, но на ощутимое количество прцентов (на глаз, конечно). На показательно чистом и красивом блоте это было бы не сложно, но где же его взять...

    2) Смущает субъективность, которую так или иначе вносишь при ручной обработке каждой дорожки. Хотя, как следует из пункта 1) пока она мне не грозит - я даже при желании "честно" не могу добиться нужного мне результата.


    В общем, прошу совета кто чем пользуется, какими функциями обработки итп итд, вдруг я чего-то еще не пробовал smile.gif

    Спасибо



    Добавлено:
    Согласен, надо было описать чуть корректней. На одном блоте есть по 4-6 образцов одного типа и столько же второго. Хочется получить "число" интенсивности для каждого и сравнить две группы на стат разницу.

    Пероксидаза --> рентгеновская пленка --> обычный сканер



    guest: ммм /24.04.2014 04:41/
    Вы просто хотите сравнить образец А и Б или вас интересует именно количество? Каким именно способом вы получаете окраску(фермент? Субстрат?). Каким способом вы получаете цифровое изображение?



    Shalty /27.11.2014 01:59/
    Здравствуйте!При проведении WB возникла следующая проблема:после проявки на пленке видно буквально все белки, что были в геле и перенеслись на мембрану (используем клеточный лизат). Пробовали блоты для разных белков, а,значит, с использованием разных первичных АТ, везде одна и та же проблема. Более того, один раз забылись и использовали protein ladder для SDS, так соответствующие полосы все проявились на пленке. Пробовали менять все буферы и ECL-результат тот же. Блокируем 5% BSA, еще 2 месяца назад с теми же реагентами все работало, не было этого чудовищного бэкграунда. С чем может быть связано такое обилие неспецифического взаимодействия? И как его избежать??



    MMM /27.11.2014 06:57/
    Обычно такая картина возникает при перегрузке вторых антител. Иногда при перегрузке первых, особенно если они поликлональные.

    Если у вас ничего не менялось, а резльтаты поменялись, то это значит, что у вас есть баг, но вы его не видите. При таком подходе невозможно его найти без тщательного расследовния.



    вова098 /27.11.2014 07:34/
    (MMM @ 27.11.2014 07:57)
    Ссылка на исходное сообщение  Обычно такая картина возникает при перегрузке вторых антител.  Иногда при перегрузке первых, особенно если они поликлональные.

    Если у вас ничего не менялось, а резльтаты поменялись, то это значит, что у вас есть баг, но вы его не видите. При таком подходе невозможно его найти без тщательного расследовния.

    https://promo.gelifesciences.com/gl/WESTERN...EL-DATAFILE.pdf ( https://promo.gelifesciences.com/gl/WESTERN-BLOTTING/misc/28997020AB-AMERSHAM-ECL-GEL-DATAFILE.pdf )








       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler