Главная страница MolBiol.ru > Методы > Белки > PAAG в неденатурирующих условиях Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

PAAG электрофорез нативных белков

Алексей Колесниченко,
Сибирский институт физиологии и биохимии растений


    Электрофорез проводили в блоках полиакриламидного геля размером 70х80х1 mm3, используя прибор для электрофореза Mini-PROTEAN II Electrophoretic Cell фирмы BIO-RAD (США).

    Стеклянные пластины, одна из которых несколько длиннее другой (83х102 и 73х102 mm2), отделяли друг от друга с помощью прокладок из органического стекла толщиной 1 mm и вставляли в устройство для заливки геля, прилагаемое к прибору для электрофореза. В просвет между стеклянными пластинами заливали раствор мелкопористого полиакриламидного геля, а после его полимеризации заливали крупнопористый гель. В последний погружали зубчатый шаблон для формирования карманов для нанесения белковых проб.

    Верхним электродным буфером служил трис-глицин, pН 8.3 (25 mM Трис и 192 mM глицин) с добавлением 0.01% SDS. Нижний электродный буфер имел такой же состав без SDS. Рабочий гель (7%) полимеризовали в 375 mM Трис-НСl буфере с добавлением 0.01% SDS, рН 8.8, а формирующий гель в 62.5 mM Трис-НСl буфере, рН 6.8. Для того, чтобы полимеризация проходила равномерно, полимеризующиеся блоки охлаждали. Для создания ровной верхней границы разделяющего геля на него наслаивали изобутанол, насыщенный водой.

    Электрофорез проводили, используя электрофоретическую ячейку прибора Mini-PROTEAN II. Стеклянные блоки прижимали специальными зажимами к передней части катодного отсека так, чтобы меньшая пластина была на уровне выреза в передней стенке прибора, а большая пластина была выше этого выреза. В электродный резервуар наливали верхний электродный буфер. Пластины опускали в нижний электродный буфер.

    Анализируемые белки растворяли в буфере, состоящем из Трис-НСl (62.5 mM, рН 6.8), 1% ß-меркаптоэтанола, 10% глицерина и 0,001% бромфенолового синего, и наносили на гель, предварительно выровняв концентрации, не более 25-30 µg белка на трек (20-25 µl образца). Первые полчаса, когда образцы входили в гель, устанавливали силу тока 50 mA на блок. Далее электрофорез проводили при постоянной силе тока 80 mA три часа, пока свидетель (бромфеноловый синий) не доходил до конца гелевого блока. После окончания электрофореза стеклянные пластины вынимали из прибора, и освободившийся гель помещали в камеру для окрашивания или использовали для переноса на нитроцеллюлозную мембрану.



MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 21793


    Комментарии

    • Методика применялась в нашей лаборатории в течение длительного времени.
    • Сдвиг заряда белков за счет присутствия в буферах и геле низкой концентрации SDS позволяет добиваться значительного сокращения времени проведения электрофореза (4 часа против 48 часов по сравнению с электрофорезом в градиенте плотности ПААГ) и значительно улучшает картинку при последующем блоттинге, при этом при данной концентрации SDS (ее все-же необходимо подбирать в зависимости от исследуемого образца) не наблюдается изменения белкового спектра за счет развала белков на субъединицы.

    Дополнения, комментарии, вопросы

    Гость /13.05.2005 13:17/
    Какой же это форез нативных белков, если есть SDS?



    А /14.05.2005 12:42/
    Ак, в многих методиках присутствует, кажись и в методах на этом сайте есть, только концентрации ДСН не те, что в денатурирующем



    Tecan /16.05.2005 08:56/
    В принципе при малой концентрации додецилсульфата можно получить даже полосы димеров.



    Shusha /17.05.2005 11:35/
    А нету ли какого-нибудь варианта нативного препаративного фореза?



    Гость /12.07.2005 11:47/
    Вообще-то рН буферов нужно подбирать каждый раз для каждого белка индивидуально. Лично я гоню гели без капли SDS, а буфер для нанесения представляет собой просто подкрашенный бромфеноловым синим р-р глицерина. Но данная методика была предварительно обкатана на моём образце другими товарищами. Так что ищите и обрящите.



    Elshad /22.01.2006 15:44/
    Мне очень нужно программы DenStar и SigmaGel



    Werta /22.01.2006 20:14/
    Если есть SDS то это вам соыершенно не нативный эликтрофорез.
    А как было правильно замечено выше - надо гнать разные белки при разном pH



    Samuray /23.01.2006 23:56/
    Сдается мне, что такой форез со следывыми количествами SDS может быть очень полезен при работе с тотальными лизатами и последующим вестерном.

    Я как-то пытался определить димеризуется или олигомеризуестя мой рецептор при активации ростовым фактором, приходилось как раз использовать тотальные лизаты и нативный форез. Картинка была страшная, и выходило, что мой рецептор в клетках тетрамеризовался. При добавлении в гель следовых количеств саркозила окрашивание антителами показало присутствие только димера. Позже мы показали что это действительно так - обычный димер. Думаю, что и мизерные кол-ва SDS будут также работать. Хотя нкто не даст грантии, что если есть димер то нет более высокой олигомеризации....



    antiximik /15.04.2006 16:42/
    Очень интересная методика... особенно если учесть, что использовали и ДДС, и меркаптоэтанол...
    Лично я подбирал условия для нативного фореза (концентрация "геля", сила тока, рН буфера для разделяющего геля и рН электродного буфера), причем НИГДЕ не присутствовали даже следовые количества ДДС, а пробы подготавливали простым смешением анализируемого раствора с бромфеноловым синим с добавлением глицерина. При этом удавалось "пронаблюдать" наличие тетрамеров, додекамеров, икосамеров... :)

    З.Ы. К минусам стоит отнести то, что "загружать" белка приходится больше, чем для "обычного" денатурирующего фореза... Дерзайте...



    Kas /26.06.2006 11:03/
    Скажите, при постановке нативного фореза при каком рН нужно гнать АТ, очищенные на DEAE?



    Kas /26.06.2006 11:05/
    Имеется в виду рН буфера, конечно! Заранее спасибо!!!



    ммм /26.06.2006 17:36/
    А это зависит от того куда вы гнать их хотите от плюса к минусу или от минуса к плюсу и нужно ли вам концентрирование или вполне достаточно дифузной зоны. К тому же это еще зависит от рI антител она у них тоже разная бывает.



    real-sugar /01.12.2006 15:24/
    Ja etim kak raz vchera zanimalsja



    Гость /13.02.2007 13:25/
    Скажите, при каких условиях фореза можно выделить чистый гемагглютинин вируса гриппа, окрашивать белок или нет?



    Гость /22.02.2007 06:52/
    как готовить образцы белков из растительного мотериала и как нанести их в гель? я не понимю процесс выравнеивания концентраций. и вообще у меня элетрофорез не получается!!!



    Krosha /27.03.2007 10:12/
    про гемагглютинин могу подсказать, если конечно еще интересует



    Guest /29.03.2007 14:30/
    каким методом лучше выделить ГА в чистом виде (форез)? Белок нужен для получения моноспецифической сыворотки (объём выделенного белка тоже важен).



    Krosha /04.04.2007 14:35/
    Ух, это Вам надо в НИИ Гриппа ..
    Возможно, дадут подробную методику.
    1. Вырастить вирус в курином эмбрионе или на культуре клеток
    2. Инактивировать формальдегидом
    3. Детергент Триметил-Цетил-Аммониум Бромид (TCAD) позволяет выделять гемагглютинин и нейраминидазу в самостоятельные субъединицы.
    4. Поверхностные белки выделяются с помощью очередного ультрацентрифугирования. Белки очищаются от детергента и внутренних составляющих вирусной частицы при помощи диализа.

    Активность выделенного белка зависит от штамма. Некоторые вообще не растут на яйцах, а только на клетках и тд. Там нюансов много. Идентифицировать ГА Вы можете в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)
    А чью сыворотку Вы собираетесь получать, если не секрет? Протокол иммунизации у Вас есть? Метод РТГА умеете ставить? Условия, чтоб с живым вирусом работать?



    SASh /12.04.2007 12:54/
    А подскажите пожалуйста поподробней, как именно с помощью TCAD выделять гемагглютинин и нейраминидазу в самостоятельные субъединицы? есть ли прописи, методики, где можно прочитать?



    Krosha /13.04.2007 15:32/
    К сожалению, я этим не занимаюсь. Не знаю. Могу только предполагать, где Вам могут помочь. Это НИИ Гриппа, у них есть сайт, обратитесь для начала туда.
    В УФЕ этим занимается Микроген. Но будут ли они кому помогать - вопрос.



    Krosha /13.04.2007 15:33/
    А Вы откуда ? И чем занимаетесь, если не секрет.
    Пишите мне в личку.



    Гость /26.04.2007 03:42/
    Ооочень прошу подсказать методику количественного извлечения нативного белка из нативного акриламида.Концентрация белка в полосе очень хилая. Yuri/26.04.2007 11:40/



    guest: ммм /16.06.2007 10:46/
    --Ооочень прошу подсказать методику количественного извлечения нативного белка из нативного акриламида.Концентрация белка в полосе очень хилая. Yuri/26.04.2007 11:40/

    Дык! это! Пихаете куски геля с вырезанной зоны в диализный пакетик и подвергаете электрофорезу в трис глициновом или трис боратном буфере. Потом извлекаете раствор из мешочка и концентрируете на микроконе или центриконе от милипора.

    Это один из вариантов.



    avor /16.06.2007 11:25/
    Антихимик! Ваша просьба отдельным топом помещена в форуме СОФТ. Здесь она совсем не в тему. lol.gif wall.gif



    Tivan /31.03.2011 18:54/
    Помогите, пожалуйста, как провести нативный форез смеси IgG IgM IgA. Пробовала в 4% нативном ПААг - смесь не входит в гель. Хочу попробовать агарозный гель. Подскажите, какой нужно использовать буфер для фореза?



    Tom1 /31.03.2011 21:37/
    (Tivan @ 31.03.2011 08:54)
    Ссылка на исходное сообщение  Помогите, пожалуйста, как провести нативный форез смеси ИгГ ИгМ ИгА. Пробовала в 4% нативном ПААг - смесь не входит в гель. Хочу попробовать агарозный гель. Подскажите, какой нужно использовать буфер для фореза?

    2-D native-PAGE/SDS-PAGE visualization of
    an oligomer’s subunits: Application to the
    analysis of IgG
    Leticia Gonzalez et. at.
    Electrophoresis 2006, 27, 2016–2023
    © 2006
    2.2.1 First-dimensional native PAGE
    IgG oligomers in sample buffer (60 mM potassium hydroxide,
    63 mM glacial acetic acid, 25% v/v glycerol,
    pH 4) were electrophoresed in a 1 mm thick first-dimensional
    discontinuous native polyacrylamide slab gel
    (4% T, 2.1% CBIS stacking gel, pH 4; 6% T, 2.1% CBIS
    running gel) under acidic conditions (pH 4) according to
    Reisfeld et al. [3] in a BioRad Mini-Protean II cell. The
    aqueous anode buffer contained potassium hydroxide
    (48.5 mM) and glacial acetic acid (4.3% v/v). The aqueous
    cathode buffer contained b-alanine (350 mM) and glacial
    acetic acid (0.8% v/v). Proteins were electrophoresed at
    constant voltage (200 V) until the tracking dye (dimethyl
    green) reached the bottom of the gel.
    2.2.2 Staining of native polyacrylamide gels
    Separated proteins were visualized by staining polyacrylamide
    gels by either the native fast silver method of
    Shevchenko et al. [4], the permanganate silver stain
    tion for 26 h at room temperature in the dark, and then
    visualizing using a Chromato-Vac Transilluminator Model
    TM 10 with a wavelength of 302 nm. Table 1 provides a
    summary of the fixing and staining protocols.



    извиняюсь что стайку не привожу полностью.
    Модеры не дают пдф файл прикреплять гы-гы)))



    plotter /01.04.2011 12:47/
    извиняюсь что стайку не привожу полностью.

    Лучше так. Статейка через две недели того. А в такой форме будет долго лежать.



    Guest /08.04.2011 12:33/
    нативный форез по мне это так себе метод, лучше уж на калиброваной колонке гель-фильтрации все делать, если уж нужно чтобы белок не денатурировал. кстати и препаративность присутствует)



    Guest /08.04.2011 12:35/
    малые кол-ва ддс между прочим все равно меняют конформацию белка. Пусть это не полная денатурация, но св-ва все равно меняются



    Aleg /26.04.2011 19:06/
    Никому не приходилось гонять лизоцим форезом без сдс? Я попытался, взяв стандартную методику SDS PAAG, но все растворы готовил без SDS и DTT, вместо бромфенолового синего взял метиловый зеленый и при гнал с обратной полярностью ( к минусу). Дак у меня в разделяющем геле краситель исчез wall.gif а при проявке в кумасе оказалось что у меня белок вообще в разделяющий не пошел.
    Белочек то щелочной, может дело в рН буферов?



    guest: ммм /26.04.2011 19:50/
    --может дело в рН буферов?

    Однозначно, кто ж щелочные белки в щелочных буферах, гоняет обратная полярность здесь не поможет.



    ERiNaCeUS /27.04.2011 13:52/
    Кислый буфер надо, например бета-аланин-ацетатный (80mM Beta-alanine + 40 mM Acetic acid = pH 4.4), еще вариант - 10mM Histidine + 30mM MES = pH 5.4. Разумеется в обратную сторону. Только ТЕМЕDа надо раз в пять больше - полимеризация идет хуже при низком рН



    guest: ммм /27.04.2011 15:07/
    -- ТЕМЕDа надо раз в пять больше - полимеризация идет хуже при низком рН

    Лучше рибофлавин и свет, если есть возможность. Много темеда портит картинку в геле.



    Aleg /27.04.2011 15:46/
    Спасиб, буду пробовать.



    ERiNaCeUS /28.04.2011 17:40/
    буфер для нанесения тоже кислый надо



    Daemonarchestratygos /29.04.2011 23:43/
    (guest: ммм @ 27.04.2011 13:07)
    Ссылка на исходное сообщение  -- ТЕМЕDа надо раз в пять больше - полимеризация идет хуже при низком рН

    Лучше рибофлавин и свет, если есть возможность. Много темеда портит картинку в геле.


    Во-во, к тому же 1% витамин В2 в любой аптеке продаётся и стоит копейки. yes.gif








       


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler