Главная страница MolBiol.ru > Методы > Белки > Осаждение белков ТХУ Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Осаждение белков трихлоруксусной кислотой

Дмитрий Жарков
Department of Pharmacological Sciences, State University of New York at Stony Brook, (631) 444 3585.

    Способ 1 (минимальная концентрация белка 5µg/ml)

  1. к раствору белка добавить 1/10 объёма 100% ТХУ;
  2. инкубировать 30' на льду или 15' при -20oC;


  3. Способ 2 (минимальная концентрация белка <1µg/ml и немного быстрее в исполнении)

  4. к раствору белка добавить 1/10 объёма 0.15% дезоксихолата натрия;
  5. выдержать 10' при NT;
  6. добавить 1/20 первоначального объема 100% ТХУ;


  7. Продолжение общее для обоих способов

  8. ЦФ 5' в эппендорфовской центрифуге на максимальной скорости;
  9. отсосать супернатант пипеткой;
  10. далее можно:

    (a) растворить в 50-100µl 0.1 N NaOH;
    (b) промыть 1ml смеси этанол-эфир 1:1 (можно несколько раз, если надо хорошо удалить кислоту), после центрифугирования осадок подсушить и растворить в нужном буфере.



MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 27208

    Растворы

    ТХУ

    Трихлоруксусная кислота,CCl3CO2H Mw=163.39,(хранить при NT, в темноте, под тягой).

    Конц.%(w/w)5ml10ml25ml50ml
    TХУ100% (w/v)68.785.0g10.0g25.0g50.0g
    H2OmQ31.222.27ml4.54ml11.35ml22.7ml

    0.15% дезоксихолат натрия

    (хранить при NT):

    Конц.Сток1ml50ml

    Deoxycholate

    0.15%тв.1.5mg75mg

    H2O

     mQ1ml50ml


    Комментарии

    Общие

  • Метод полезен, когда концентрация белка в растворе слишком мала для анализа, или объем слишком велик, чтобы нанести нужное количество белка на гель. Источник: Bollag, D.M., Edelstein, S.J. (1991). Protein Methods. Wiley-Liss, Inc., New York, p.72-3.

    Дополнения, комментарии, вопросы

    к /06.06.2005 18:54/
    По моему опыту получается, что количество соосадителя завышено раз в 10, что приводит к существенным потерям на стадии промывания.



    _Sanya_ /11.01.2006 02:33/
    К пункту 8.
    Осадок белка можно промывать однократно ледяным ацетоном (80% - 100%)



    Serg-66 /30.11.2006 02:40/
    Что-бы, при отмывке белка ацетоном не осаждались соли (что не очень хорошо при электрофорезе) можно предварительно промыть осадок 1 мл 10% ТХУ



    Layelleth /25.01.2007 18:06/
    Сработает ли осаждение ТХУ, если мне нужно отделить белок от липидов перед электрофорезом?
    - Липиды по моему опыту очень мешают обычному денатурирующему форезу в ПААГ - если их много. А в моем случае липидов много



    Tom1 /25.01.2007 18:40/
    Практически нет.....



    guest: ммм /26.01.2007 13:09/
    От липидов наверное лучше избавлятся осаждением белка ацетоном.



    lirrok /01.02.2007 14:14/
    Подскажите, пожалуйста, как высаживаются белки ацетоном или дайте ссылку. Спасибо.



    guest: ммм /01.02.2007 14:34/
    ---Подскажите, пожалуйста, как высаживаются белки ацетоном или дайте ссылку. Спасибо.

    Ну как,как? Если количественно весь белок высаживать, то охладить раствор с белком до 00С, а ацетон градусов до -20 и медленно, в течении минутки, долить 4-5V ледяного ацетона в раствор белка, перемешивая, и на -200 - минимум на час, максимум - навсегда.

    Время выдержки на -20 зависит от концентрации белка: если белка очень много то может хватить и 10', если мало, то суток обычно достаточно.

    Внимание! В ацетоне практически нерастворимы неорганические соли, поэтому, если они присутствуют в высоких концентрация в исходном растворе белка, то выпадают в осадок вместе с белком и загрязняют его.



    lirrok /01.02.2007 14:45/
    Простите, если задаю глупые вопросы, т.к. в работе с белками - новичок. А что дольше делать? Мыть? В чём растворять после? Нужно ли сушить и т.д.?



    lirrok /01.02.2007 14:46/
    Опс
    Не "дольше", а "дальше" :-)



    Oleg Klychnikov /01.02.2007 15:43/
    (guest: ммм @ 01.02.2007 11:34)
    Ссылка на исходное сообщение 
    Внимание!  В ацетоне практически нерастворимы неорганические соли, поэтому, если они присутствуют в высоких концентрация в исходном растворе белка, то выпадают в осадок вместе с белком и загрязняют его.

    4 объема ацетона к одному объему белка (80%)
    на ночь на -20 и будет вам счастье
    после этого фуговать эдак 10-20(30) мин, эдак 10-20 kg при 4С
    отобрать супер, сушить - можно на спидваке, можно просто
    открыть эппендорфу, если нужна активность после такого
    издевательства, то сушить лучше на -20 с открытыми пробирками

    и фсе
    надо только иметь ввиду, что как любой метод преципитации,
    ацетонирование имеет свои ограничения на количество белка
    (если его мкг - то надо ко-преципитировать), на всякие разные
    детергенты, если есть в буфере (белок просто может не сесть),
    ну и всяки другие прелести,
    так, что лучше всего пробовать на не очень дорогом для сердца
    образце пилотное высаживание


    только в этом топике - это офф-топ tongue.gif lol.gif



    Гость /26.03.2008 18:57/
    плиз, никогда не высаживайте сукрозный градиент ацетоном!



    Guest /27.03.2008 22:29/
    Даже после солюбилизации SDS белок хорошо высаживается, если сначала проинкубировать 1 час на холоду с 10% ТХУ (в конечной концентрации), а затем разбавить равным объемом ацетона и оставит на ночь при -20 град, как здесь и советовали.



    Гость /08.04.2008 18:04/
    а мы промываем от ТХУ обычным охлажденным -20С этанолом



    plotter /29.01.2009 17:36/
    А как отмыть осажденный тху осадок от тритона?



    guest: ммм /29.01.2009 18:11/
    -А как отмыть осажденный тху осадок от тритона?
    А почему вы думаете, что он там остается. Тритон вроде в ТХУ растворим.

    Ну промойте метанолом, а затем метанолом с изобутанолом, вот как-то так.



    Vadim Sharov /29.01.2009 22:29/
    МММ, прав: отмойте раза два осадок тем же ТХУ, а само ТХУ холодным ацетоном.



    david /29.01.2009 22:39/
    ... Но лучше этих осаждений избегать. уж хлопотное это дело растворять осаздхенный белок. Я как то взял клетки с тарелки 10 см и выделял белок разным объемом лизис буфера. вестерн вышел одинаковый. С тех пор, я всегда сначала клетки соскребываю ПБС-ом, делаю спин даун, и полученный осадок растворяю в 50-100 микроллитров лизис буфера



    plotter /30.01.2009 11:59/
    ммм, думаю так, потомучто осадок в сравнении с контролем, насыщеннее раза в 3. И pH другой сильно. И оно мылкое малость.
    Но тут такая система, что и не такое бывает...



    guest: ммм /30.01.2009 14:07/
    --ммм, думаю так, потомучто осадок в сравнении с контролем, насыщеннее раза в 3.

    Гхм! А может это дезоксихолат или любые другие органические кислоты(или их соли).

    --И pH другой сильно.
    ЧТО!!! рН НЕ КИСЛЫЙ?!!
    Значит вы мало льете кислоты(ТХУК) или у вас исходно сильно щелочная среда возможно имеет смысл подкислить ее перед осаждением уксусом или фосфорной кислотой. Тритон на рН не влияет и сам вроде в кислой среде растворим.



    plotter /30.01.2009 16:04/
    Нет там солей (почти). Так, остатки незначительные, фрагменты микромолей.
    Дезоксихолат не заказал ещёsmile.gif
    Бум курить...



    Гость /27.03.2009 10:47/
    Подскажите, пожалуйста!!! Я хочу выделить белок из эндотелиальных микрочастиц плазмы крови. Пробовала разрушать мембрану микрочастиц ультразвуком, а потом осадить ацетоном.После оставила на -20 на ночь, отцентрифугировала, высушила осадок, который потом растворила в буфере - но концентрация белка оказалась очень мала - что делать?



    Гость /07.04.2009 22:35/
    Подскажие, пожайлуста, что подойдет для мгновенной коагуляции белка для качественного анализа? Почему именно ТХУ так распространена для осаждения? Каков механизм ваимоействия ТХУ с беком?



    Vadim Sharov /08.04.2009 03:11/
    (Гость @ 07.04.2009 21:35)
    Ссылка на исходное сообщение  Подскажие, пожайлуста, что подойдет для мгновенной коагуляции белка для качественного анализа? Почему именно ТХУ так распространена для осаждения? Каков механизм ваимоействия ТХУ с беком?

    Есть такой автор Остерман. Почитайте. wink.gif



    guest: plotter /24.02.2011 18:07/
    Нашел в тяговом шкафу около 2-х литров ТФУ (трифтор...) Как она работает в плане осаждения? Не пробовал кто?



    Daemonarchestratygos /24.02.2011 18:25/
    (guest: plotter @ 24.02.2011 16:07)
    Ссылка на исходное сообщение  Нашел в тяговом шкафу около 2-х литров ТФУ (трифтор...) Как она работает в плане осаждения? Не пробовал кто?

    Зависит от плана осаждения. wink.gif



    guest: ммм /24.02.2011 18:50/
    --Нашел в тяговом шкафу около 2-х литров ТФУ (трифтор...)

    Я думаю вам их с радостью обменяют на 100кг ТХУК



    Seleniti /27.02.2012 22:10/
    Подскажите пожалуйста,для чего после осаждения белка 5 % ТХУ, затем охлажденным 95 % ацетоном нужно осадок растворять в 0,5 N NaOH при нагревании?Для того,чтобы избавиться от ТХУ?Или для чего другого?



    guest: ммм /28.02.2012 06:27/
    ---Подскажите пожалуйста,для чего после осаждения белка 5 % ТХУ, затем охлажденным 95 % ацетоном нужно осадок растворять в 0,5 N NaOH при нагревании?Для того,чтобы избавиться от ТХУ?Или для чего другого?

    1) В обсуждаемом протоколе, указанные вами процедуры отсутствуют.
    2) От ТХУК вы не избавитесь, просто она перейдет в соль тихлорацетат натрия.



    guest: валерий /07.11.2012 13:02/
    осадил белок тху, после чего не нашел N-конца. Не может ли тху алкилировать аминогруппы белка?



    guest: ммм /07.11.2012 15:15/
    --осадил белок тху, после чего не нашел N-конца. Не может ли тху алкилировать аминогруппы белка?

    Алкилировать не может, может ацилировать. Но вероятность низкая, возможно ваш белок модифицировался еще на стадии(ях) где-то до осаждения.








       


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler