Главная страница MolBiol.ru > Методы > Белки > Осаждение сульфатом аммония Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Осаждение белков сульфатом аммония

По книге Clive Dennison "A guide to protein isolation".

  1. определить аналитической раститровкой при каких концентрациях (NH4)2SO4 осаждает нужный белок;
  2. добавить к раствору белка нужное количество (NH4)2SO4;
  3. инкубировать приблизительно 30' со слабым перемешиванием на нужной температуре;
  4. осадить преципитат центрифугированием;
  5. если осаждение ступенчатое - добавить следующую порцию (NH4)2SO4, повторить пп.3-4;
  6. слить супернатант;
  7. коротким ЦФ сбросить на дно остатки супернатанта, убрать их пипеткой;
  8. растворить белок в нужном буфере.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 43674

    Растворы

    (NH4)2SO4

    Ammonium Sulfate, (NH4)2SO4, Mw=132.1g/M
    Конц.Сток%(w/w)50ml100ml250ml
    (NH4)2SO43M132.1g/M33.28919.82g39.63g99.08g
    H2O mQ66.71139.71ml79.42ml198.55ml
    1000ml/
    132.1g/M1M2M3M4M4.5M
    (NH4)2SO4 [g]132.1
    264.2
    396.3
    528.4
    594.45
    H2O [ml]939
    870.1
    794.2
    713.3
    671.25
    %(w/w)12.33323.29233.28942.55546.966
    H2O %(w/w)87.66776.70866.71157.44553.034
    p (g/ml) 20oC1.07111.13431.19051.24171.2657
  • Растворимость (NH4)2SO4 почти постоянна в диапазоне 0-30oC: 4.1М.


    Комментарии

    Общие

    Обычно, когда говорят о высаливании, имеют в виду высаливание именно сульфатом аммония. Этому методу уже более 130 лет. Раньше он применялся и для фракционирования, сейчас, в основном, как дешёвый и удобный метод осаждения белков. Можно считать, что повезло, если при этом получается ещё и существенная очистка (при высаливании из клеточного экстракта можно расчитывать на приблизительно 2-10 кратное обогащение).


  • Почему именно сульфат аммония?
    • При равной молярной концентрации поливалентные анионы долее эффективны для высаливания, чем моновалентные (отчасти из-за того, что имеет значение не концентрация соли, а ионная сила раствора), а поливалентные катионы даже препятствуют действию поливалентных анионов. Получается, что оптимально сочетание - это поливалентный анион с моновалентными катионами.
    • Эффективность высаливания убывает в серии Гофмейстера (Hofmeister):

      Цитрат > Сульфат > Фосфат > Хлорид > Нитрат > Тиоционат

      В этом же ряду убывает стабилизирующий эффект и возрастают хаотропные свойства соли. Таким образом, наиболее подходящие кандидаты: цитрат и сульфат. Сульфат более удобен из-за лучшей растворимости (например, при нормальной температуре растворимость аммонийных солей цитрата и сульфата равны примерно 2.5М и 4.1М); низкой цены и стабилизирующего влияния, которое он оказывает на большинство белков при концентрациях выше 0.5М.

  • (NH4)2SO4 преципитируют белки по двум механизмам
    1. сульфат-ионы делают молекулу белка более компактной (менее растворимой) за счёт взаимодействия с положительно заряженными аминокислотами. Это взаимодействие более эффеективно при pH<pI.
    2. обезвоживание. Один ион SO42- имеет 13-14 молекул H2O только в первом гидратном слое и, возможно, больше - во втором. Если одна молекула сульфата координирует даже 15 молекул H2O, то 3M сульфат аммония связывает 45 из имеющихся в воде 55M молекул H2O.

  • Ионная сила раствора
      I = 1/2 сумма ci(zi)2, где:
      • ci - концентрация иона;
      • zi - заряд иона.
      Например, для 1M NaCl: I = 1/2 (1(1)2 + 1(1)2) = 1
      для 1M (NH4)2SO4: I = 1/2 (2(1)2 + 1(1)2) = 3

  • Растворимость белков
    • Влияние ионной силы и температуры
           При низкой ионной силе (<0.2M) растворимость белка увеличивается при повышении концентрации соли, так как экранирование притяжения противоположно заряженных групп приводит к разрыхлению структуры белка.
           При высокой ионной силе (>0.2M) - растворимость белка понижается из за высаливания и обезвоживания. Она падает экспоненциально с повышением ионной силы: logS = ß - KsI, где:

      S[g/l] - растворимость белка;
      I - ионная сила;
      ß; Ks - константы.

      Ks - слегка различается для различных белков и почти не зависит от pH и температуры. ß - сильно зависит от белка, pH и температуры; повышение температуры вызывает понижение ß => уменьшение растворимости белка.
    • Влияние pH.
           При низкой ионной силе (<0.2M) растворимость белка минимальна при pH равном изоэлектрической точке белка.
           При высоких концентрациях (NH4)2SO4 растворимость повышается с повышением pH, так как при низких pH сульфат ион компактизует белок взаимодействуя с положительно заряженными группами. Так что лучше проводить осаждение при pH<pI.
    • Влияние начальной концентрации белка
           Белки бывают двух типов. Для типа I растворимость не зависит от исходной концентрации белка; для типа II - зависит сильно.

  • Ограничения метода
    • Высокая концентрация ионов аммония в осадке может мешать точному определению концентрации белка.
    • Высаливаются не только белки, но и, например, детергенты. Например, 0.5% Tween 20 и Triton X100 начинают агрегировать при концентрациях сульфата аммония больше 1M. Образующийся преципитат имеет плотность чуть меньше плотности солевого раствора. При центрифугировании он всплывает, прихватывая с собой белки.
    • Осаждение сульфатом амония нельзя использовать для белков, требующих присутствия Ca2+ из-за нерастворимости сульфата кальция.


  • По пунктам

    п. 1.

  • Обычно, при концентрациях ниже 1М (25% от насыщения) осаждаются лишь крупные частицы, преагрегированные или очень крупные белки. Приемлемая серия концентраций: 0M; 1M(25%); 1.6M(40%); 2.4M(60%); 3.2M(80%).
  • п. 2.

  • Можно добавлять кристаллический ацетат аммония или насыщенный раствор (а если требуется высокая точность, то 4М раствор). Первый способ удобнее, когда требуется высокая концентрация сульфата аммония или не хочется сильно увеличивать объём образца. В любом случае, соль добавляется при непрерывном перемешивании, чтобы не создавалась слишком высокая локальная концентрация соли.
  • п. 3.

  • Чем выше температура, тем ниже растворимость белков, но тем выше опасность денатурировать белок. Обычно осаждение проводится при 0oC, хотя благодаря тому, что (NH4)2SO4 стабилизирует белки и предотвращает рост бактерий, её можно проводить и при 25oC.
    /дополнение от KSN/

    Можно добавить только одно: проблема соосаждения примесных белков не отражена в должной мере. Для достижения равновесия, а значит максимальной степени очистки (она может быть существенной) раствору (суспензии) белка стоит постоять в холодильнике не один день (если хватит терпения). Имеется опыт.

  • п. 4.

  • Белковый преципитат опускается на дно пробирки, так как имеет плотность в районе 1.29g/ml (плотность насыщенного р-ра сульфата аммония - 1.24g/ml).
  • Обычно достаточно 10' 4krpm, 4oC. При высоких концентрациях соли и низкой концентрации белка могут потребоваться большие время/скорость. При больших концентрациях белка, когда видны хлопья преципитата, можно сажать на совсем низкой скорости.
  • п. 8.

  • Обычно достаточно 1-2 объёмов осадка.




Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


    Дополнения, комментарии, вопросы

    _pmaria_ /11.01.2006 03:32/
    Растворимость сульфата аммония в воде при 20 С около 5.7М, причем при 0 градусов снижается примерно на 0,5М, не верите, возьмите справочник, или проверьте сами.



    _nafanin_ /11.01.2006 03:47/
    В разделе осаждение белков сульфатом аммония в примере с рассчётом ионной силы(второй случай), по-моему необходимо читать:I=1/2*(2*(1)^2+1*(2)^2), поскольку заряд сульфат иона, записанный в скобках во втором слагаемом, равен 2. Тогда и ответ получается верным



    genseq /12.01.2006 10:41/
    Изучал высаливание билихромопротеидов (фикоцианина и фикоэритрина) синезелёных водорослей в 1974 году. Белки ярко окрашены и за их поведением очень удобно наблюдать. При этих наблюдениях выяснилось, что "в действительности всё совсем не так, как на самом деле". Для полного перехода белков из раствора в осадок достаточно изменить насыщенность раствора сульфата аммония всего на 0,1...0,2%. Но осадок вблизи этой концентрации (точки осаждения) очень неустойчив. Растворяется даже от вибрации центрифуги. Поэтому для его отделения от раствора можно использовать только фильтрование, причём с очень низкими скоростями (1...2 мл/см2 в минуту). Сам знаю, что это противоречит всем канонам, но это было подтверждено не только фильтрованием, но и измерением оптической плотности растворов при различных концентрациях соли. При длительном стоянии растворов с повышающимися концентрациями сульфата аммония без вибрации и перемешивания оптическая плотность окрашенных белков на графике растворимости падает почти отвесно.



    Гость /01.06.2006 13:51/
    Для осаждения иммуноглобулинов из желтка яиц, я использовал аммония сульфат в конечной концентрации 50%, однако центифугированием никак не удалось осадит преципитат.Во всех случаях получался пленка состаяшаяся из липопротеидов и иммуноглобулинов.



    Vladimir Matveev /15.06.2006 10:58/
    Новейшие данные о рядах Гофмейстера читайте в статье:
    Lo Nostro P, Ninham BW, Milani S, Lo Nostro A, Pesavento G, Baglioni P.
    Hofmeister effects in supramolecular and biological systems.
    Biophys Chem. 2006 Apr 26; (корректура)



    Майя /04.03.2007 09:36/
    скажите пожалуйста как влияет размер белка на эффективность его высаливания сернокислым аммонием,
    есть ли какая либо зависимость типа чем меньше белок тем хуже высаливается?



    Алексей Соколов /04.03.2007 12:55/
    Для эффективности высаливания важнее конечная концентрация белка в растворе и соотношение гидрофильных и гидрофобных аминокислотных остатков на поверхности глобулы. Конечно, белки меньше 5-10 кДа высаливать труднее, потому что мелкие гидрофобные частицы слипаются и осаждаются хуже. Правда тут есть ухищрения: можно добавить несколько баластных белков (выпадающих при разных насыщающих концентрациях и, от которых потом легко избавиться) с ними легче соосаждаются маленькие белки в низкой концентрации.



    Fritz /04.03.2007 14:30/
    2 Maya: A eshe mojno precipitirovat "bolshie" belki,esli takovie prisutstvujut v smesi,s pomoshju poliethylenglykolja 6000.Interesujushaja Vas "meloch" budet v supernatante plavat.Vy ego prosto skoncentrirujte potom v slide-A-lysere polojiv etu kameru s rastvorom na Sephadex ili PEG smile.gif



    Guest /04.03.2007 17:50/
    Зависимость о размера есть, но не прямая. Лучше высаливаются кислые белки. Желательно работать при высокой концентрации белков. При низкой образование осадка идёт медленнее. По этой причине обычно рекомендуется использовать высаливание на самой первой стадии - для грубых экстрактов, содержащих большое количество примесей. При этом идёт сильное соосаждение, т.е. целевой белок захватывается осадком даже помимо своего "желания". Оптимальный вариант - это экстракционное высаливание, т.е. сначала осаждаете белок со всеми примесями, а потом растворяете осадок в дистиллированной воде и добавляете насыщенный раствор сульфата аммония в требуемой пропорции. Осадок растворяете и высаливаете повторно, но соотношение воды и соли понижаете, и т.д. Ко всем полученным супернатантам добавляете насыщенный раствор соли, центрифугируете и получаете серию осадков, в которых ищете свой белок. Если точка высаливания известна, то сразу ориентируетесь на требуемое соотношение воды и насыщенного раствора соли. Ступенчатую экстракцию можно проводить повторно и с различными интервалами процента насыщения раствора соли. Для крупных белков можно добиться осаждения в интервале 1...2% насыщения, причём без существенных потерь. Для мелких интервал требуется немного шире (3...5%).

    Главное - дистиллированную воду брать только свежекипячёную. Иначе белки погибнут от "кессонной болезни".



    bukach /04.03.2007 22:59/
    наверное, в общем и целом, маленькие белки будут высаливаться хуже. но и зависимость от других их свойств и от присутствия в растворе других белков тоже будет немалой.

    помимо вышеуказанных способов, эффективность высаливания можно повысить еще
    1. изменением рH. вблизи pI растворимость белка уменьшается.
    2. увеличением температуры. например, до комнатной. с увеличением температуры гидрофобные взаимодействия, на которых преимущественно высаливание и зиждется, услиливаются. но это подойдет если интересующий белок достаточно термостабилен и не сильно подвержен протеолизу.



    kenny /04.03.2007 23:33/
    боюсь, с pH не шибко получится, потому что:
    1) сернокислый аммоний сам изменяет рН - закисялет, так что вопрос - хватит ли буферной емкости
    2) если и хватит - тот же самый сернокислый аммоний создает немалую ионную силу, так что кулоновские взаимодействия, на которых в основном основывается изоэлектрическое осаждение, будут невелироваться, думается

    с температурой согласен



    bukach /05.03.2007 00:34/
    (kenny @ 04.03.2007 23:33)
    Ссылка на исходное сообщение  боюсь, с pH не шибко получится, потому что:
    1) сернокислый аммоний сам изменяет рН - закисялет, так что вопрос - хватит ли буферной емкости
    2) если и хватит - тот же самый сернокислый аммоний создает немалую ионную силу, так что кулоновские взаимодействия, на которых в основном основывается изоэлектрическое осаждение, будут невелироваться, думается


    1. рН можно довести после добавления СА
    2. правда ваша. но, думается, уменьшение электростатического отталкивания при приближении к pI будет способствовать лучшему "слипанию" и за счет гидрофобных взаимодействий.
    как бы то ни было, но это работает. например, один из методов очистки ГАФД на этом основан.



    Fritz /05.03.2007 11:03/
    2 Maya: A vy sluchem ne FEN NGU zakanchivali?



    guest: Гость /09.04.2007 14:36/
    тиоцинат амония



    Guest /08.08.2007 06:02/
    При осаждени белка персульфатом аммония насколько важно чтоб центрифугирование проводилось с охлаждением? и достаточно ли 10000 т.о. (на цф типа эппендорф) минут пяти?



    форма жизни /08.08.2007 08:44/
    Вы слегка перепутали. Персульфат аммония - реактив, который используется обычно для инициации полимеризации акриламидного геля. Белки фракционируют сульфатом аммония. Для осаждения (переосаждения) белков сульфатом не обязательно охлаждать все в процессе ц/ф. Вполне можно обойтись настольной высокооборотной центрифугой (эппендорф очень даже подходит). Условия ц/ф (время и обороты) зависят от конечной концентрации сульфата аммония в растворе.
    Если конечная концентрация сульфата не превышает 0,8 насыщения (это около 3,2М или 0,55 г/мл) то можно крутить 10-12 тыс. об/мин, 3-4 мин. Только перед ц/ф предварительно охладите пробирки в холодильнике (лучше в морозилке, но не переусердствуйте, чтобы не замерзло все).



    Guest /08.08.2007 10:08/
    спасибо!
    да что-то у меня замкнуло приписать ПЕР к сульфату...



    guest: ммм /08.08.2007 12:30/
    Кстати, иногда при высоких концентрациях сульфата белки не тонут, а всплывают.

    Табличка насыщения сульфата дана при 0С, при комнате растворимость сульфата выше и следовательно процент насыщения при той же концентрации ниже. Но все это фигня, потаму чта сульфат есть грубый реагент и никакие тонкости не повысят точность фракционирования.



    genseq /09.08.2007 11:55/
    (guest: ммм @ 08.08.2007 10:30)
    Ссылка на исходное сообщение  Кстати, иногда при высоких концентрациях сульфата белки не тонут, а всплывают.

    ... все это фигня, потаму чта сульфат есть грубый реагент и никакие тонкости не повысят точность фракционирования.


    Белки могут всплывать как при высоких, так и при низких концентрациях сульфата аммония. При растворении соли выделяются микропузырьки воздуха, которые придают осадкам белка положительную плавучесть. Для борьбы с этим желательно:
    1. Растворять исходный препарат белка в свежекипячёной воде (буфере).
    2. Добавлять не соль, а её насыщенный раствор.
    3. Если осадок всё-таки всплыл, то его можно не отцентрифугировать, а отфильтровать.

    Сульфат - очень тонкий реагент, позволяющий фракционировать даже близкие по свойствам белки. Мне удавалось при помощи высаливания разделить фикоцианин и фикоэритрин синезелёной водоросли, отличающиеся только хромофорной группой. Высаливание при этом проводилось изменением насыщения соли на 0,1%.

    Есть множество тонкостей, позволяющих повысить точность фракционирования при высаливании белков.



    guest: ммм /13.08.2007 13:39/
    --Сульфат - очень тонкий реагент, позволяющий фракционировать даже близкие по свойствам белки. Мне удавалось при помощи высаливания разделить фикоцианин и фикоэритрин синезелёной водоросли, отличающиеся только хромофорной группой. Высаливание при этом проводилось изменением насыщения соли на 0,1%.

    НЕ ВЕрю!!! Особенно, если в смеси была хотябы еще парочка десятков других белков в значимой концентрации. Хотя с конкретно этими белками я не знаком возможно это и так, но это скорее исключение чем правило.

    Есть множество тонкостей, позволяющих повысить точность фракционирования при высаливании белков.

    А клоны антител не пробовали делить из поликлональных сывороток. smile.gif

    Белки могут всплывать как при высоких, так и при низких концентрациях сульфата аммония.

    Ага! А плотность раствора соли тут ни при чем. smile.gif



    Guest /13.08.2007 15:39/
    (guest: ммм @ 13.08.2007 13:39)
    Ссылка на исходное сообщение  --Сульфат - очень тонкий реагент, позволяющий фракционировать даже близкие по свойствам белки. Мне удавалось при помощи высаливания разделить фикоцианин и фикоэритрин синезелёной водоросли, отличающиеся только хромофорной группой. Высаливание при этом проводилось изменением насыщения соли на 0,1%.

    НЕ ВЕрю!!! Особенно, если в смеси была хотябы еще парочка десятков других белков в значимой концентрации.  Хотя с конкретно этими белками я не знаком возможно это и так, но это скорее исключение чем правило.


    Высаливание проводилось из грубого лизата синезелёных водорослей, содержащего десятки основных и тысячи дополнительных белковых примесей.

    "НЕ ВЕрю!!! "

    С тех пор я не верю учебникам, описывающим красивую теорию высаливания белков.

    Спустя пару десятков лет развлекался с выделением пероксидазы хрена. У неё точка высаливания где-то на 68 % насыщения. Точнее не определял, но основную часть примесей удавалось убрать высаливанием в интервале 5% насыщения. tongue.gif



    форма жизни /13.08.2007 15:49/
    Вообще-то воможность проводить тонкое фрационирование белков, меняя концентрацию сульфата аммония на 0,1% вызывает ОЧЕНЬ большие сомнения. Сульфат-аммонийное фракционирование прекрасный метод, он особенно хорош для фракционирования лизатов-гомогенатов, сывороток и т.д., легко маштабируется, хорошо воспроизводится, но не надо делать из него какую-то "сверхметодику сверхочистки". Что касается флотации белка после высаливания, то "всплывание" белка определяется и концентрацией сульфата аммония и природой белка.
    Например, при фрационировании гомогената печени 0,7 насыщения сульфата, белок всплывает, а У.З.-лизат E.coli - осаждается. Это еще зависит и от скорости высаливания - genseq абсолютно прав насчет микропузырьков воздуха. Вот только фильтровать сульфатаммонийный осадок - задача непростая и неблагодарная. Лучше открутить (если есть на чем), т.к. при 20000g в 0,8 насыщения сульфате на стенки пробирки садится любой осадок. Если вам пришлось высаживать белок сульфатом до полного насыщения, то тогда или фильтровать или крутить на ультраценрифуге при 80000-100000g.



    Guest /13.08.2007 20:10/
    --С тех пор я не верю учебникам, описывающим красивую теорию высаливания белков.

    По учебникам как раз получается, что возможно все. smile.gif
    Это были Вы, Ильич?

    --Например, при фрационировании гомогената печени 0,7 насыщения сульфата,

    Та, язный пень, чем больше липидов связано с белками, тем легче оне взплывають, как на парашюте.



    genseq /14.08.2007 09:13/
    (форма жизни @ 13.08.2007 13:49)
    Ссылка на исходное сообщение  Вообще-то воможность проводить тонкое фрационирование белков, меняя концентрацию сульфата аммония на 0,1% вызывает ОЧЕНЬ большие сомнения.


    Не сомневайтесь. Интервал 1...2% вполне работоспособен. С интервалом 0,1% будут заморочки, но и это вполне реально. Нужно только использовать не повышение концентрации, а экстракционное высаливание с понижающейся концентрацией. Могу поделиться секретами и тонкостями этого метода, но боюсь, что это уже никому не нужно frown.gif . Народ давно уверовал в гель-хроматографию, иоообменники, HPLC и прочие навороты. Бороться со сторонниками общепринятых подходов - занятие крайне неблагодарное weep.gif .



    genseq /14.08.2007 09:14/
    (Guest @ 13.08.2007 18:10)
    Ссылка на исходное сообщение  --С тех пор я не верю учебникам, описывающим красивую теорию высаливания белков.

    По учебникам как раз получается, что возможно все. smile.gif
    Это были Вы, Ильич?


    Это был Витальич.



    NBSC /14.08.2007 09:21/
    (genseq @ 14.08.2007 07:13)
    Ссылка на исходное сообщение  Не сомневайтесь. Интервал 1...2% вполне работоспособен. С интервалом 0,1% будут заморочки, но и это вполне реально. Нужно только использовать не повышение концентрации, а экстракционное высаливание с понижающейся концентрацией. Могу поделиться секретами и тонкостями этого метода, но боюсь, что это уже никому не нужно frown.gif . Народ давно уверовал в гель-хроматографию, иоообменники, HPLC и прочие навороты. Бороться со сторонниками общепринятых подходов - занятие крайне неблагодарное weep.gif .


    Уважаемый genseg, не поделитесь ли секретами? Мне иногда приходится работать в "полевых условиях" при отсутствии прочих возможностей. Использую обычно высаливание сульфатом, процедура отработана уже. Но если есть тонкости процесса, буду очень благаодарна за помощь. Спасибо.



    genseq /14.08.2007 12:47/
    Основные принципы довольно просты, но мне уже неоднократно доставалось от местных всезнаек. По этой причине лучше обсуждать вопросы высаливания в приватной переписке. Если интерес серьёзен, то жмите на рисунок письма над этим сообщением и пишите на E-mail.



    форма жизни /15.08.2007 10:47/
    Уважаемый genseq. Экстракционное высаливание действительно очень хорошая модификация сульфат-аамонийного фракционирования. Не требует ни какого специального оборудования или реактивов, дает неплохой выигрыш в очистке при существенном снижении потерь целевого белка на соосаждении с другими. На мой взгляд, эти плюсы с лихвой компенсируют незначительное удлинение всей процедуры. Правда, этот вариант требует гораздо большей тщательности и аккуратности в работе - просто более высокой биохимической культуры.
    Но вот на счет работоспособности фракционирования с интервалом 1% и даже с еще меньшим интервалом...?!?!. Вам крупно повезло, что ваш конкретный белок, который вы выделяете из вашего источника можно фракционировать сульфатом со ступелькой 1% насыщения. Только на сколько целесообразно расширять такое везение, когда вы не знаете о каком белке, из какого источника и для каких целей (т.е. какая нужна чистота) его будет выделять гость? Есть три достаточно серьезных довода, из-за которых фракционирование сульфатом аммония с шагом менее 5% насыщения используется крайне редко независимо от модификации метода (прямое высаливание или экстракция):
    1. Многие белки вообще не имеют четкой "точки высаливания" в силу своей природы. Наиболее известный пример (но, увы, далеко не единственный) - это нуклеозиддифосфаткиназа (NDPK). Этот фермент высаливается в интервале от 0,5 до 0,95 насыщения сульфата и все попытки сузить интервал концентраций сульфата или поменять высаливание на экстракцию только приводят к потерям целевого фермента.
    2. Подобрать точную концентрацию сульфата, оптимальную для высаливания какого-либо белка, задача достаточно кропотливая. Как ни крути, но для любого варианта надо уметь определять содержание вашего целевого белка в некоторой фракции в присутствии высокой концентрации сульфата аммония. А если ваш белок - это фермент, активность которого подавляется сульфатом? Хорошо, если вы располагаете возможностью детектировать содержание вашего целевого белка напрямую по какой-нибудь экзотической флюорисценции или что-то в этом роде. А как насчет пробоподготовки для белкового э/ф из концетрированного раствора сульфата? Хлопотное и муторное это занятие, а мы , увы, все достаточно ленивы.
    3. Всякий метод фракционирования (в том числе и белков) количественно оценивается по степени очистки. Во сколько раз вы очищаете ваш белок на конкретной стадии. Обычно очистка целевого белка до гомогенного состояния по э/ф требуется не часто и для многих задач вполне достаточно очистки по белку в 100-500 раз от исходного гомогената. Если ваш источник - не суперпродуцент вашего продукта, то такая очистка не очень высокая, но во многих случаях вполне приемлема. Сульфат-аммонийное фракционирование, даже самое тонкое, редко дает очистку по белку больше, чем в 4-5 раз. Мне всего однажды крупно повезло и искомый антиген чистился сульфатом аж в 11 раз, но это редкая удача и никакой моей заслуги в том не было - уж очень специфические условия высаливания оказались. Вся остальная очистка "добивалась" хроматографией.
    Вообще, позволю себе "крамольную мысль" - сульфат аммония "лучше помогает" не при фракционировании белков. Вам приходилось выделять белки (или ферменты) не из сыворотки крови или культуральной жидкости, а из гомогената ткани? Представляете себе гомогенат печени крысы или минтая, гомогенат человеческой плаценты или икры морского ежа до оплодотворения или гомогенат эмбрионов морского ежа на средней бластуле? Сколько там всего "биологического материала" в растворе, кроме белка? Это не кристаллических змеинный яд и даже на гомогенат E.coli. Цвет и запах весьма специфические и как-то про хроматографию забываешь на прочь. А тут сульфат аммония - богом созданный реагент. Одно-два высаливания - и у вас "благородный белковый раствор". Очистка по белку 3-4 раза - это ерунда, но вы избавились от липидов, полисахаридов, каких-то пигметов, массы низкомолекулярной "шелухи" и даже частично от нуклеиновых кислот. После этого и на колонку не грех, и на э/ф пожалуйста.
    Сульфат-аммонийное фракционирование - очень достойный и крайне полезный метод, но совсем не "волшебная палочка". Впрочем, думаю, что если вы поделителсь с менее опытными коллегами своим опытом, это будет просто замечательно за что вам заранее спасибо.



    guest: ммм /15.08.2007 13:00/
    Форма жизни!!!

    ++11 beer.gif jump.gif



    genseq /15.08.2007 15:18/
    Огромное спасибо форме жизни. Постараюсь соответствовать заданному им уровню дискуссии и поделиться своим небольшим опытом в деле высаливания белков, тем более, что письма от NBSC я так и не получил rolleyes.gif .

    В стародавние времена довелось мне делать дипломную работу в Ин-те биологии внутренних вод и водоёмов. Тамошние биологи пожелали сделать "что-нибудь биохимическое" и для этой цели выписали студента-биохимика (т.е. меня). Единственным объектом, с которым можно было успеть сделать хоть что-нибудь путное, оказались синезелёные водоросли, а единственным удобоваримым прибором - спектрофотометр СФ-4. Поневоле пришлось заняться ярко окрашенными белками - билихромопротеидами. Центрифуги там тоже не было (не говоря уж об ионообменниках) и кроме высаливания, причём с фильтрованием осадков, воспользоваться было не чем. Кстати, фильтров тоже не было, поэтому использовалась обычная стекловата, которой набивались сделанные из пипеток колонки.

    Первые же эксперименты показали, что для отделения осадков наиболее критичным параметром является скорость фильтрования. Если она превышала 1...1,5 мл/мин*см2, то ярко-синие осадки уходили в проскок. Но на малой скорости и при последовательном повышении концентраций окрашенные белки нарушали все известные теории - при достижении критической концентрации сульфата аммония растворимость ярко-синего фикоцианина падала до нуля, причём очень резко - при изменении насыщения раствора сульфатом аммония всего на 0,1-0,2%. Правда, испортить весь опыт могла даже небольшая вибрация рабочего стола. На синих белках это было очень хорошо заметно.

    Для подтверждения подобного "аномального" высаливания фикоцианина был поставлен незасимый эксперимент - растворы с разной концентрацией сульфата аммония были приготовлены прямо в кюветах спектрофотометра, и образование осадков оценивалось по снижению оптической плотности раствора. Графики высаливания и в этом случае оказались аномальными - растворимость падала практически отвесно, но осадки вблизи точки высаливания были чрезвычайно лабильными - переходили опять в раствор даже при незначительных вибрациях, связанных с перемещением кювет.

    Впоследствии такой характер высаливания был продемонстрирован и на гемоглобине крови. От экспериментов с кровью у меня до сих пор остался небольшой шрам на руке weep.gif .

    Основной вывод таков:
    описанные в литературе формулы и кривые растворимости белков, обоснованые экспериментами на вибрирующих центрифугах, описывают не истинную картину высаливание белков, а устойчивость белковых осадков к вибрациям центрифуги umnik.gif .

    Ну а следствия этого вывода и способы использования данного феномена для тонкой очистки белков с помощью высаливания постараюсь описать завтра. Сейчас уже пора убегать tongue.gif .



    Ъ /15.08.2007 19:31/
    Форму Жизни я тоже благодарю beer.gif Уважаю smile.gif А Генсека стал еще больше уважать beer.gif



    klav /16.08.2007 09:07/
    Прикрепить сию полезную тему к методическому разделу форума!
    umnik.gif umnik.gif smile.gif
    Вот например сюда http://molbiol.ru/protocol/17_15.html ( http://molbiol.ru/protocol/17_15.html )



    genseq /16.08.2007 18:07/
    Похоже, пора от преамбулы переходить к амбуле - к хитростям, которые должен знать каждый начинающий высаливатель белков.

    1. Кессонная болезнь, т.е. образование микропузырьков при растворении соли или при смешивании её насышенного раствора с водой. Это приводит к значительным потерям, поскольку осадки начинают всплывать, а часть белков в них необратимо денатурируется. При однократном высаливании этими потерями можно пренебречь, но при многократном высаливании теряется всё.

    Проблема решается использованием для растворения осадков перед повторным их осаждением свежекипячёной ("обезгаженной") воды.

    2. Соосаждение, т.е. захват осадками белков, которые при данной концентрации соли ещё вполне растворимы.

    Если высаливать белки повышением концентрации соли, то их соосаждение приводит к получению очень невнятных результатов. а вот если идти не снизу в верх, а сверху вниз, и проводить экстракционное высаливание, то с соосаждением можно бороться повторной экстракций.

    В общих чертах экстракционное высаливание выглядит следующим образом:
    а) к смеси белков в буфере добавить равный объём насыщенного раствора сульфата аммония (если начинать с 50% насыщения);
    б) отцентрифугировать и слить супернатант в отдельную пробирку (фракция >50% насыщения);
    в) осадок растворить в 5,5 мл "обезгаженной" воды и смешать с 4,5 мл насыщенного раствора сульфата аммония;
    г) отцентрифугировать и слить супернатант в отдельную пробирку (фракция 45...50% насыщения).
    д) см. сказочку про попа и его собаку. Отличается только соотношение воды и раствора соли - 6:4; 6,5:3,5; 7:3.

    При таком подходе можно повторять пункты в) и г) тем же соотношанием 5,5:4,5. При этом из осадка извлекаются белки, которые обязаны пребывать во фракции 45...50%.

    Ко всем полученным супернатантам (по 10 мл) можно добавить по 1 мл насыщенного раствора соли, получить осадки и провести повторное экстракционное высаливание с интервалом 1...2% насыщения. Потери, связанные с соосаждением белков, будут уже намного меньше.

    Кстати, чем чище препарат белка, тем меньше проявляются фокусы, связанные с соосаждением.

    Продолжу завтра rolleyes.gif .



    Яра /16.08.2007 21:53/
    Класс! С нетерпением буду ждать продолжения yes.gif
    Но, если можно, поподробнее confused.gif насчет субъединичных белков. Как вся эта роскошь работает с ними?
    А то у меня в работе белок уже рефолдированный eek.gif



    guest: NBSC /16.08.2007 22:49/
    Уважаемый genseq, извините за поздний ответ. Не всегда есть возможность воспользоваться интернетом. Все, что вы уже рассказали, безумно интересно! Сейчас постараюсь осознать собственные ошибки в работе и исправить положение. Если будет продолжение - всеми конечностями - за! Спасибо!!!



    genseq /17.08.2007 21:30/
    Боюсь, что девушки ждут молока от старого козла. Ну-ну... rolleyes.gif . Впрочем, на кое-что я ещё способен wink.gif .

    Как правило, при высаливании ориентируются на минимальную концентрацию сульфата аммония (процент насыщения), при которой требуемый белок выпадает в осадок. Более продвинутые специалисты предпочитают использовать интервал концентрации соли, который обычно составляет от 10 до 20% насыщения и очень редко - 5%. Метод считается очень грубым и используется на самой первой стадии, когда требуется избавиться от липидов, грубого дебриза, углеводов и низкомолекулярных примесей, способных загубить дорогостоящия колонки (см. форму жизни). При этом большие потери считаются нормой жизни.

    В действительности всё совсем не так, как на самом деле. Высаливание пригодно и для грубой очистки (причём без особых потерь), и для тонкого фракционирования.

    Для грубой очистки необходимо знать интервал насыщения, при котором белок выпадает в осадок (10...20% насыщения). Основные потери связаны с соосаждением целевого белка, ну а способ борьбы с этим (повторное экстракционное высаливание) мы уже обсуждали. Впрочем, из каждого правила есть исключения - например, захват белка осадком может быть обусловлен и межмолекулярной сшивкой сульфгидрильных групп, но подобные фокусы и способы борьбы с ними нужно обсуждать отдельно.

    Итак, после экстракционного высаливания грубого лизата (центрифугированного гомогената) с интервалом насыщения 10...20% обычно получается белковый осадок кремового цвета, содержащий основную часть целевого белка и пригодный, например, для гель-хроматографии. После этого можно переходить к высаливанию с интервалом 2...5%. Только не нужно забывать о том, что для каждого белка характерен не интервал, а точка высаливания, значение которой отличается исключительной стабильностью. Многократные центрифугирования (или фильтрования) необходимы только для максимально точного определения этой точки. В дальнейшем головной боли от жужжания центрифуги будет намного меньше.

    Скорость формирования осадков при высаливании белков очень сильно зависит от их концентрации. Разведённые растворы (<мг/мл) выпадают в осадок очень медленно. Их приходится оставлять в холодильнике на ночь. Следовательно, лучше работать с концентрированными растворами. Это значит, что если вы получили 1...2 г (или мл) белкового осадка, то не нужно его разводить слишком сильно. Воды должно быть достаточно для растворения осадка (3...6 мл), но не намного больше (100...200 мл). Для работы с граммовыми количествами осадков вполне достаточно центрифужных пробирок на 10...50 мл, а с сотнями миллиграмм можно работать и в эппендорфовских пробирках.

    Концентрация сульфата аммония в осадке обычно близка к той, которую Вы собираетесь использовать на следующей стадии экстракционного высоливания, поэтому ей обычно можно пренебречь, т.е. если 1...2 г осадка получено из интервала 40...50% насыщения, то его можно растворить в 5,2 мл воды ("обезгаженной") и добавить 4,8 мл насыщенного раствора соли. При этом в растворе останется фракция 48...50%, а в осадке останутся белки, выпадающие при 40...48%. Концентрация соли в исходном осадке (50% насыщения) сместит (повысит) пороговую концентрацию на 10..20%, но это от 2% интервала, т.е. истинное смещение составит 0,02...0,04%. При повторной экстракции этого же осадка, проводимой для извлечение соосаждённого белка, смещение концентрации осадком будет уже совсем незначительным.

    Если точка высаливания Вашего белка известна и равно 49% насыщения, то предыдущие разглагольствования можете считать методикой его очистки. Интервал высаливания при этом - 2%. После этого можно добавить к объединённым супернатантам немного (до 50...55% насыщения) сульфата аммония, отцентрифугировать, растворить осадок (100...200 мкл) в 0,5 мл воды и провести гель-хроматографическую доочитску, а заодно и обесссоливание.

    Впрочем, можно продолжить и высаливание полученной белковой фракции, но уже с интервалом концентрации соли 0,2...0,5% насыщения. Кстати, это делается уже на миницентрифуге.

    Проблем и хитростей ещё очень много, но на сегодня, по-моему, достаточно.

    Уф. mol.gif



    genseq /18.08.2007 08:10/
    Кстати, о высаливании. Этот вопрос уже обсуждался на форуме:
    http://molbiol.ru/forums/lofiversion/index.php/t152632.html ( http://molbiol.ru/forums/lofiversion/index.php/t152632.html )

    Вопрос был сформлирован следующим образом:
    Майя, 04.03.2007 07:36
    скажите пожалуйста как влияет размер белка на эффективность его высаливания сернокислым аммонием, есть ли какая либо зависимость типа чем меньше белок тем хуже высаливается?

    Ну а мой ответ не слишком сильно отличался от всего вышесказанного:

    "Зависимость от размера есть, но не прямая. Лучше высаливаются кислые белки. Желательно работать при высокой концентрации белков. При низкой образование осадка идёт медленнее. По этой причине обычно рекомендуется использовать высаливание на самой первой стадии - для грубых экстрактов, содержащих большое количество примесей. При этом идёт сильное соосаждение, т.е. целевой белок захватывается осадком даже помимо своего "желания". Оптимальный вариант - это экстракционное высаливание, т.е. сначала осаждаете белок со всеми примесями, а потом растворяете осадок в дистиллированной воде и добавляете насыщенный раствор сульфата аммония в требуемой пропорции. Осадок растворяете и высаливаете повторно, но соотношение воды и соли понижаете, и т.д. Ко всем полученным супернатантам добавляете насыщенный раствор соли, центрифугируете и получаете серию осадков, в которых ищете свой белок. Если точка высаливания известна, то сразу ориентируетесь на требуемое соотношение воды и насыщенного раствора соли. Ступенчатую экстракцию можно проводить повторно и с различными интервалами процента насыщения раствора соли. Для крупных белков можно добиться осаждения в интервале 1...2% насыщения, причём без существенных потерь. Для мелких интервал требуется немного шире (3...5%).
    Главное - дистиллированную воду брать только свежекипячёную. Иначе белки погибнут от "кессонной болезни".



    Яра /18.08.2007 20:12/
    (genseq @ 17.08.2007 22:30)
    Ссылка на исходное сообщение  Боюсь, что девушки ждут молока от старого козла. Ну-ну...  rolleyes.gif . Впрочем, на кое-что я ещё способен wink.gif .


    Вот что меня безумно радует в мужчинах yes.gif , так это их уникальное кокетство и способность напрашиваться на комплименты shuffle.gif



    genseq /19.08.2007 14:02/
    Вообще-то это была самокритика redface.gif .



    Ъ /19.08.2007 15:47/
    (genseq @ 19.08.2007 14:02)
    Ссылка на исходное сообщение  Вообще-то это была самокритика redface.gif .

    Генсек, уже поздно - Яна уже втюрилась виртуально. lol.gif Но вы же там соседи... smile.gif



    Яра /19.08.2007 21:05/
    (Ъ @ 19.08.2007 16:47)
    Ссылка на исходное сообщение  Генсек, уже поздно - Яна уже втюрилась виртуально.  lol.gif Но вы же там соседи... smile.gif

    Во-первых, прошу не путать Яру с Яной, с детства этого не терплю shuffle.gif
    Во-вторых, таки да, "тащусь от зрелых мужей и мифических чудовищ" lol.gif lol.gif lol.gif .
    Ну что за инфантилизм: стоит даме сказать комплимент, как начинаются всякие инсинуации redface.gif
    В-третьих, мне лично лекция очень понравилась cool.gif .



    форма жизни /20.08.2007 11:13/
    Уважаемый genseq. Завидую вашей удачливости. Вам удается растворять 1-2г белкового осадка в 5 мл воды (наверное, лучше все-таки буфера?). Увы, мне не везло с белками и растворы с концентрацией белко 100 мг/мл у меня не получаются. Наверное, мы недопонимаем друг друга. Я говорю о суммарном белке, концентрация которого измеряна (в соответствующем разведении, конечно) по Бредфорду или по Лоури. А вы о каком белке?
    Кстати, об экстракции белков сульфатом. Все, что вы написали про переосаждение (по моему опыту) полностью соответстует получаемым мною результатам, за исключением растворимости белка. Обычно у меня не растворяется белковый сульфат-аммонийный осадок (например, из гомогената E.coli) в концентрации более 20 мг/мл.
    Но есть весьма забавная модификация экстракции сульфатом. Для этого сначала вы высаживаете суммарный белок заведомо большей концентрацией (например, 0,8 насыщения, против 0,7, которое нужно для вашего белка). Отделяете осадок, супернатант (или фильтрат) отбрасываете, а осадок растворяете, но не в воде или в буфере, а в растворе сульфата аммония с концентрацией ниже той, которая необходима для высаливания вашего белка (например, 0,6 насыщения). Растворение лучше проводить ночь при +4 и соотношение осадок:раствор сульфата лучше брать 1:25 или 1:30. Полученную суспензию отцентрифугировать (или отфильтровать, если вам так привычнее) и теперь супернатант (или фильтрат) содержит ваш целевой белок с приличной очисткой. Добавьте к этому супернатанту опять сульфама аммония до нужной вам концентрации и получите очень приличную очистку целевого белка с небольшими потерями.



    genseq /20.08.2007 11:16/
    (Ъ @ 19.08.2007 13:47)
    Ссылка на исходное сообщение  Генсек, уже поздно - Яна уже втюрилась виртуально.  lol.gif Но вы же там соседи... smile.gif


    Dear Ъ,

    не думаю, что "уже поздно", но мне нравится ход твоих мыслей rolleyes.gif .



    genseq /20.08.2007 11:54/
    Спасибо форме жизни. Он совершенно прав, но я постараюсь быть ещё правее.

    1. Белки, как правило, растворяют в буфере, предназначенном для поддержания заданного pH. Сульфат аммония - соль кислая. Её растворы имеют pH~5,0, а попытки защелочить их до привычного всем нейтрального или слабощелочного значения приводят к появлению аммиачной вони. Лучше просто не бояться кислых значений pH. Их денатурирующее воздействие на белки при высаливании, как правило, компенсируется повышением стабильности белков в концентрированных солевых растворах. Кстати, некоторые ферменты, плохо переносящие лиофилизацию (бета-галактозидаза и т.п.) хранятся и поставляются в виде суспензии в растворе сульфата аммония.

    Скорее всего, из этого правила есть исключения. Тогда лучше использовать для высаливания забуференные растворы сульфата натрия или насыщенные растворы двузамещённого фосфата натрия (pH~8,6).


    2. Растворимость белков очень сильно зависит от ионной силы растворов. При низкой ионной силе растворимость многих белков незначительна, а если ещё и pH соответствует изоэлектрической точке белка, то он может вывалиться в осадок полностью. На этом основан метод изоэлектрического осаждения, активно использовавшийся на заре энзимологии. При повышении ионной силы растворимость быстро увеличивается и может достигать запредельных значений. Наконец, при приближении концентрации соли к точке высаливания растворимость снижается. Если белок очищенный, то она падает практически отвесно. Если очень "грязный", то график имеет куполообразных характер, сглаженный эфектами соосаждения.

    Форма жизни совершенно прав. В буферном растворе многие белки растворяются весьма посредственно. Но вот сульфат-аммонийные осадки в небольшом объёме воды растворяются необычайно хорошо. Можно, конечно, растворять их и в небольшом объёме буфера, но это приведёт к непредсказуемости pH, так что лучше использовать именно воду. Будет, конечо, кисловато, но лучше так, чем иметь головную боль от непредсказуемой pH или от постоянного запаха аммиака frown.gif .



    genseq /20.08.2007 12:01/
    (форма жизни @ 20.08.2007 09:13)
    Ссылка на исходное сообщение ... Но есть весьма забавная модификация экстракции сульфатом. Для этого сначала вы высаживаете суммарный белок заведомо большей концентрацией (например, 0,8 насыщения, против 0,7, которое нужно для вашего белка). Отделяете осадок, супернатант (или фильтрат) отбрасываете, а осадок растворяете, но не в воде или в буфере, а в растворе сульфата аммония с концентрацией ниже той, которая необходима для высаливания вашего белка (например, 0,6 насыщения). Растворение лучше проводить ночь при +4 и соотношение осадок:раствор сульфата лучше брать 1:25 или 1:30. Полученную суспензию отцентрифугировать (или отфильтровать, если вам так привычнее) и теперь супернатант (или фильтрат) содержит ваш целевой белок с приличной очисткой. Добавьте к этому супернатанту опять сульфама аммония до нужной вам концентрации и получите очень приличную очистку целевого белка с небольшими потерями.


    В целом горячо одобряю, а вот в частности Вы описали несколько ухудшенную модификацию экстракционного высаливания. Ухудшение заключается в том, что при растворении осадка (фракции 80% насыщения) в растворе сульфата аммония (60% насыщения) потери целевого белка будут выше, чем при полном растворении осадка. Слишком много его останется в соосаждённом виде с белками фракции 0...60%. Ну а как этого избежать мы уже рассматривали umnik.gif .



    klav /20.08.2007 12:54/
    Ну ни тема, а учебник по высаливанию!
    Огромное спасибо девушкам, без которых этого бы не было! wink.gif beer.gif



    Ъ /20.08.2007 14:07/
    (klav @ 20.08.2007 12:54)
    Ссылка на исходное сообщение  Ну ни тема, а учебник по высаливанию!
    Огромное спасибо девушкам, без которых этого бы не было!  wink.gif  beer.gif

    Среди нас только одна девушка - это Яра! Признаю. что Ярослава могла вдохновить мужчин на подвиги, а Генсека точно smile.gif .



    Redactor /20.08.2007 14:43/
    На форуме было по крайней мере три темы о высаливании. Сейчас они объединены в одну и эта тема прикреплена к методике высаливания в "Методах" (смотри первое сообщение в теме).



    genseq /21.08.2007 07:57/
    (Ъ @ 20.08.2007 12:07)
    Ссылка на исходное сообщение  Среди нас только одна девушка - это Яра! Признаю. что Ярослава могла вдохновить мужчин на подвиги, а Генсека точно smile.gif .


    Прошу прощения, но мне бы хотелось сказать "несколько тёплых слов" Ирине, участвующей здесь под ником NBSC.

    У неё очень непростая задачка - выделение в полевых условиях физиологически активного высоколабильного белка из гемолимфы, причём осаждается он при 70...75% насыщения сульфата аммония. Основная задача - уменьшить потери, связанные как с высаливанием, так и с инактивацией.

    Все белки сыворотки крови (и не только) на заре их препаративной химии были разделены на глобулины, осаждающиеся при 50% насыщения сульфата аммония, и альбумины, не выпадающие при этой концентрации соли в осадок. В соответствии с этой классификацией белок Ирины относится к альбуминам и является далеко не самым лучшим объектом для высаливания. Кроме того, известна только ориентировочная концентрация, при которой он выпадает в осадок (70...75% насыщения). Попытаюсь дать несколько самых общих советов, в правильности которых не слишком уверен. Дело в том, что при высаливании подобных белков исключений может быть не меньше, чем правил.

    1. Определите концентрацию соли (нижнюю границу), при которой белок ещё не выпадает в осадок, или частично выпадает, но может быть экстрагирован (см. выше разглагольствования о соосаждении). Если это 60% насыщения, то удастся избавиться от всех глобулинов и даже от значительной части альбуминов. Хорошо бы высолить основной альбумин вашей гемолимфы. При этом и потери могут быть незначительными (стабилизирующее влияние высоких концентраций соли), и очистка весьма ощутимой.
    2. Попытайтесь как можно точнее найти концентрацию соли, при которой происходит полное высаливание Вашего белка (верхняя граница). Для этого используйте не сумарный препарат гемолимфы, а её фракцию, не выпавшую в осадок при подборе нижней границы.

    Похоже, Ваша проблема ещё и в том, что даже при 75% насыщения есть подозрения, что значительная часть белка остаётся в супернатанте. С более высокими концентрациями соли работать уже слишком проблематично. В таком случае лучше перейти с высаливания на другие способы концентрирования (ультрафильтрация, обратный осмос и т.п.).

    Кроме того, требуемой физиологической активностью могут обладать несколько белков. В этом случае получить достаточно внятные результаты при солевом фракционировании будет невозможно.

    Существуют и индивидуальные особенности белков, мешающие их очистке при помощи высаливания. В общем, возможны проблемы wall.gif , но из-за их непредсказуемости лучше сейчас не заморачивать Вам голову. Начните с поиска точного интервала высаливания, а там будет видно.

    Успехов!



    Гость /21.08.2007 10:13/
    Добрый день! Уважаемые коллеги!
    У нас достаточно гидрофобный белок. В состав лизирующего буфера входит мочевина. Можно ли как-то использовать метод высаливания? Совместимо ли использование мочевины с этим методом?



    форма жизни /21.08.2007 10:25/
    Вообще-то, заниматься сульфат-аммонийным фракционированием белков в полевых условиях дело очень сложное. Правда, понятие "полевые условия" довольно растяжимое и зависит от конкретного "поля". Выделение из гемолимфы - значит объект беспозвоночные, скорее всего моллюски, и следовательно, объем исходного материала весьма ограничен. Лучше всего "засолить" белок сульфатом, собрать осадок (можно фильтрацией), довести до лаборатории и там с ним работать.
    Не бойтесь высолить белок "с запасом", сделайте 0,9-0,95 насыщения при +4 и после ночного перемешивания отфильтруйте белок. Только не пытайтесь "подсушить" осадок, пусть будет влажным - иначе белок денатурирует. Часто высаливание лучше проводить из буфера, содержащего ДТТ (дитиотрейтол). Если вам известно, что белок легко окисляется или есть какие-то предположения на этот счет, то 5мМ ДТТ могут облегчить жизнь.



    форма жизни /21.08.2007 11:39/
    Наличие мочевины в лизирующем буфере никак не мешает высаливанию белков. Только два замечания: 1) если концентрация мочевины в лизирующем буфере высокая, то уже свыше 0,5 насыщения сульфата белок будет флотировать. Это не страшно, но создает некоторые неудобства - надо ц\ф при более высоких оборотах чем обычно; 2) ваш белок из сульфат-аммонийного осадка скорее всего не будет растворяться в воде (буфере), если не добавить мочевины.
    И еще имейте в виду, что присутствие мочевины изменит "точки высаливания" других белков, что для вас тоже может иметь значение.



    Гость /21.08.2007 18:35/
    Форма жизни, спасибо!



    guest: NBSC /21.08.2007 22:16/
    Форма жизни и genseq, спасибо! Ваша информация для меня очень важна.
    У меня отработана методика получения нужного белка с помощью хроматографии после высаливания, с которой я работаю уже давно, но хочется попробовать еще и другие способы. Иногда получаются дополнительные варианты разделения.
    Еще раз спасибо, отправляюсь на море работать. После возвращения напишу, помогло ли.



    Guest /24.10.2008 17:11/
    Извините за глупый вопрос: а почему Нуклеиновые кислоты сульфатом не высаживатся? Почему сульфат от них с таким же успехом воду не отнимает?



    guest: ммм /26.10.2008 00:20/
    Нуклеиновые кислоты сильно гидрофильнее белка. Чтобы они выпали сами собой нужно либо добавить спирт. Либо создать специальные условия,например сильноразвитую поверхность, типа селикагеля, он же гласмилк.



    Яна /28.10.2008 22:44/
    (Ъ @ 19.08.2007 12:47)
    Ссылка на исходное сообщение  Генсек, уже поздно - Яна уже втюрилась виртуально.  lol.gif Но вы же там соседи... smile.gif

    Я так понимаю, что уже поздно что либо писать, но я Яна и реально существую на сайте уже давно, поэтому папрашу осторожнее с никами wink.gif только на сайт захожу очень редко поэтому только сейчас прочитала про "инсинуации" в мой адрес. А за тему спасибо, несколько полезных идей для себя подчерпнула.



    Guest /29.10.2008 10:19/
    Высаливание биополимеров ингода преподносит удивительные сюрпризы. Лет 20 назад был опубликован и запатентован весьма оригинальный способ выделения ДНК из молок лососевых раб с помощью высаливания. Суть очень проста. Гомогенат молок обрабатывается сульфатом аммония до 0,9 насыщения по сульфату и полученный весьма мутный раствор разбавляется водой в 10 раз. Выпадает в осадок (точнее всплывает) ДНП - комплекс ДНК-протамин, который легко отделяется от всего остального фильтрованием или центрифугированием. Затем ДНП растворяют в 2 М NaCl и теперь уже чистую ДНК отфильтровывают от денатурированного белка и высаживают спиртом. Фактически идет "игра" на разной растворимости ДНК, белков и комплекса ДНК-протамин (ДНП) в растворах солей разной концентрации. На Хабаровском химфармзаводе даже было изготовлено несколько партий ДНК по этой технологии.



    Ъ /29.10.2008 11:30/
    (guest: ммм @ 25.10.2008 23:20)
    Ссылка на исходное сообщение  Нуклеиновые кислоты сильно гидрофильнее белка. Чтобы они выпали сами собой нужно либо добавить спирт.

    ... либо цетавлон... confused.gif



    Гость /25.02.2009 21:18/
    А вот как выяснилось да же без добавления спирта или участия сильноразвитой поверхности в осадок попадает низкомолекулярные НК уже при 70% от точки насыщения. Выпадают они сами по себе или по той причине что сами связыны с выпадающими белками-не проверялось, но теоритически в такой высокой ионной силе ионные взаимодействия неосуществимы, и если это действительно падение НК из-за связи с белком, то эти НК связаны с белками водородными связями. Короче так или иначе-падают НК при добавлении сульфата.



    Guest /26.02.2009 09:24/
    Что-то вас занесло. Возьмите любую ДНК, которую вам не жалко и попытайтесь ее высолить любой концентрацией сульфата. Увы, осадок не образуется. Поэтому ваше "выяснилось" это просто некорректно поставленный эксперимент.
    Соосаждение нуклеиновых кислот с белками при сульфат-аммонийном фракционировании - это рядовое хорошо известное явление. Клеточный лизат или разрушеная ткань или еще какой-либо первичный биологический источник нужного вам белка (фермента) фракционируют сульфатом аммония, но при этом все понимают, что на начальном этапе ВСЕГДА происходит соосаждение НК, точнее соосаждаются фрагменты нуклеиновых кислот весьма гетерогенные по мольвесу и составу. При дальнейшей очистке от НК отделяются.
    Так что не путайте, пожалуйста, разные понятия. Высальвание белков сульфатом и соосаждение нуклеиновых кислот белковыми сульфат-аммонийными осадками - это разные процессы.



    Гость /12.03.2009 21:19/
    =) Уважаемый критик, прочтите внимательно предпоследний пост:"в осадок попадает низкомолекулярные НК ...,Выпадают они сами по себе или по той причине что сами связыны с выпадающими белками-не проверялось".
    "В осадок"-имеется ввиду осадок, обазующийся в клеточном лизате при добавлении к нему сульфата аммония.
    Ясное дело что НК сульфатом из водного раствора не высадятся =), но вот то что не будет 100% очистки от них - показано.
    Рад что факт соосаждения для вас-очевидная и общеизвестный процесс.



    Гость /26.03.2009 21:24/
    *поправочка: "то что не будет 100% очистки от них(НК) ПРИ ОСАЖДЕНИИ БЕЛКОВ КЛЕТОЧНОГО ЛИЗАТА - показано"
    *очевидный



    guest: Алиса /13.10.2009 12:05/
    Здравствуйте!
    У меня вопрос не профессионала, а человека всего лишь интересующегося.
    При высаливании сульфатом аммония различных фракций белков из плазмы крови что происходит с липопротеинами, не осаждаются ли они, не изменяют ли своих свойств?!! В справочниках по биохимии ничего по этому поводу не нашла!
    Заранее спасибо большое!



    guest: ммм /13.10.2009 14:45/
    --не осаждаются ли они

    Должны.

    --не изменяют ли своих свойств?

    Строго говоря они их изменяют уже тогда, когда вы извлекли их из кровотока.
    Но если подходить к этому вопросу грубо.
    Не должны!








       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler