Главная страница MolBiol.ru > Методы > Белки > Окрашивание коллоидным Кумасси G250 Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Окрашивание белковых гелей коллоидным Кумасси G250

Маша Поседко
Strasbourg, France

    Отмывка от SDS

  1. 3x 10мин. в воде;


  2. Окрашивание

  3. окрашивать в Staining solution 2-4 часа;


  4. Отмывка от несвязавшегося красителя.

  5. в воде.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 16286

    Растворы

    Staining solution

    Конц.Сток300ml500ml1000ml
     Сульфат аммония /(NH4)2SO48%тв.24g40g80g
     Фосфорная кислота1.6%100%4.8ml8.0ml16ml
     Coomassie G2500.08%тв.240mg400mg800mg
     H2O mQ223.88ml373.13ml746.26ml
     
     Этанол*20%96-100%60ml100ml200ml
  • (*) - удобно добавлять этанол отдельно (непосредственно перед использованием).
  • Кумасси очень плохо растворяется в данных условиях. Он может не раствориться полностью или при окрашивании начать выпадать на стенках и на поверхности геля - это нормально. Фон уйдет при отмывке.


    Комментарии

    Общие

  • Достоинства метода:
    • довольно высокая чувствительность (обычно заявляется 5-10ng на пятно, то есть на порядок меньше, чем у окраски серебром, но раз в 5 выше, чем у стандартного окрашивания Coomassie R250);
    • простота;
    • низкий фон;
    • отличная совместимость с масс-спектрометрией;
    • по сравнению с коммерческими растворами коллоидного кумасси - значительно более низкая цена.
  • Найти первоисточник именно этого протокола уже не представляется возможным. В таком виде, как здесь, протокол представлен, например, на сайтах proteomics.missouri.edu или proteomics.uchsc.edu.

  • По пунктам

    п. 1.

  • Очень важно хорошо отмыть от SDS!
  • Если белки очень мелкие и легко вымывающиеся из геля или вы работаете с большими (2D) гелями: предпочтительнее вместо отмывки водой фиксировать гель в теченийе часа в любом стандартном фиксаторе (этанол/ацетате, этанол/ фосфорная кислота, и т.п.)
  • п. 2.

  • Я использую G250 от Sigma - у них порошок называется "brilliant blue G", код #B-0770 пятиграмовая банка стоит около 40 Евро.
  • Окраска начинает проявляться где-то минут через 30; развитие окраски видно глазом, так как фон остается практически прозрачным.
  • п. 3.

  • После отмывки нельзя долго хранить гель в воде, так как происходит дальнейшее отмывание.


    Дополнения, комментарии, вопросы

    yaden /13.06.2005 12:38/
    Здесь лежит статья с усовершенствованием этого метода http://newjournal.kcsnet.or.kr/main/j_sear...tm?code=B021105 ( http://newjournal.kcsnet.or.kr/main/j_search/j_download.htm?code=B021105 )



    Mac-1 /17.06.2005 22:03/
    Описаный в статье реагент продает Pierce как "Gel code Blue".

    Коллоидная окраска хорошо работает только на тонких и сверхтонких гелях (0.5 mm и тоньше, типа PhastGel), для 0.75-1 мм лучше применять краску такого состава:

    5 мг Кумасси R-250
    10 мг Кумасси G-250
    10 мг Amido black
    ------------------
    100 ml 10% Уксусной кислоты

    Гель разбухает при окраске, что обеспечивает лучшую диффузию краски внутрь, при отмывке в 5% уксусной/20% метанол он возвращается к обычному размеру.



    гость: г /19.06.2005 15:30/
    Стандартный способ с 10-20% сульфатом аммония у меня работал нестабильно. Я титровал разок БСА, было видно 5 нг, как, примерно, видно 50нг при обычном R-250.
    Обычно использовал коллоидное Кум.после окрашивания стандартным способом с R-250 для усиления окраски слабых полос, но красить надо сутки, помогало.



    yaden /01.11.2005 15:41/
    Самая свежая статья по этому методу:
    G.Candiano et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis 2004, 25, 1327–1333.
    http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin...565269/ABSTRACT ( http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/abstract/108565269/ABSTRACT )

    Делаю как в статье, только метанол заменяю на этанол - работает хорошо. Но полгода не хранится... проверено.



    Гость /11.01.2006 01:58/
    Это - калька SympleBlue Microwave Protocol from Invotrogen (1,0 и 1,5мм минигели) ©

    Пологаю, для него подойдет раствор любого коллоидного кумасси - я делал это с био-радовским 161-0786. Итак:

    1. Поместить гель в 100мл ультра-чистой воды и греть в микроволновке при 950-1100Вт ----- 1 минута.
    2. Покачать гель на орбитальном шейкере и
    слить воду ----- 1 минута.
    3. Дважды повторить этапы 1 и 2 ----- каждого по 1 минуте.
    4. Добавить 20-30мл коллоидного кумасси и погреть в микроволновке при 950-1100Вт ----- 45-60 секунд.
    5. Покачать на орбитальном шейкере.
    Слить краску ----- 5-10 минут.
    6. Мыть гель покачиванием в 100мл ультрачистой
    воды ----- 10 минут.
    7. Влить в воду 20мл 20%NaCl и качать ----- 5-10 минут.
    (8. При желании повторить этап 6, чтобы убрать
    фон ----- 1 час).

    Еще отсебятина: жидкости буквально кипят, но 3%ПААГ или градиентный 3-8%ПААГ остаются целыми, чуствительность неплохая - я красил после трансфера/20 часов и, к своему удивлению, что не все перенеслось. Надеюсь, это те 5нг, про которые пасали на фирме. А фон белый-белый.



    plotter /11.12.2008 19:11/
    У меня вопрос, а кто пробовал растворит обычный (не пудра-образный) сульфат аммония в фосфорной кислоте? Сколько это может времени занять? Я на шейкер поставил, уже час плюхается, но эффекта не заметно... Пробую наваять http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin...565269/ABSTRACT ( http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/abstract/108565269/ABSTRACT ) но 13гр соли не хочет растворяться в 13мл эсида.



    plotter /12.12.2008 12:37/
    Народ, коллоидом никто не красит чтоли?



    plotter /22.07.2010 16:08/
    Написано, что после отмывки нельзя долго хранить. Некоторые гели месяцами валяются забытыми в холодильнике, под сантиметровым слоем обычного дистиллята. И все полосочки видно как на свежепрогнанном.



    guest: ммм /22.07.2010 20:33/
    -Народ, коллоидом никто не красит чтоли?
    Я другим протоколом красил там ТХУК и сульфата и фосфорки нет.

    --под сантиметровым слоем обычного дистиллята.
    Это зря лучше все же в уксусе низкомолекулярные белочки размываются в водице, а то и совсем из геля выходють.

    -Написано, что после отмывки нельзя долго хранить.
    Может коллоидный кумаси легко отваливается от геля, не знаю.



    plotter /11.08.2010 18:23/
    Это зря лучше все же в уксусе низкомолекулярные белочки размываются в водице, а то и совсем из геля выходють
    ~12.5kDa. Сидят как вкопанные.








       


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler