Главная страница MolBiol.ru > Методы > Белки > Методы Мерион Брэдфорд и Лоури Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Определение концентрации белка (Брэдфорд; Лоури)

Андрей Шанько,
Всероссийский Институт Агрономической Биотехнологии (Москва), Tel: +7-095-9766544

    Метод Мэрион Брэдфорд

  1. довести объём образца до 0.5ml водой;
  2. добавить 0.5мл реагента;
  3. перемешать и ждать развития окраски (от 5', но не больше 30');
  4. измерить OD595 (в 1ml кювете);
  5. рассчитать концентрацию белка по калибровочной кривой построенной по БСА


    Метод Лоури

  1. довести объём образца до 0.8ml водой;
  2. добавить 0.2ml 50% ТХУ (конечная концентрация 10%);
  3. перемешать, подождать 10' и центрифугировать 10' при 14000rpm;
  4. супернатант слить и добавить к осадку
         150µl 1М NaOH,
         50µl 10% SDS,
         0.75ml раствора D (смесь А и В, 50/1),
         50µl реактива Фолина,;
  5. перемешать и ждать развития окраски 30';
  6. измерить OD750 (в 1ml кювете);
  7. рассчитать концентрацию белка по калибровочной кривой построенной по БСА


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 64933

    Растворы

    Реагент (Брэдфорд) (1л)

    100мг кумасси G-250 растворить в 50ml спирта и добавить 100ml ортофосфорной кислоты, довести до 1л водой и профильтровать через бумажный фильтр.
    Внимание! реагент очень чувствителен к белку (1-2µg/ml). Все должно быть абсолютно чистым и посуда и бумажный фильтр и кюветы и руки, иначе раствор посинеет и его можно будет вылить. Чистый раствор Брэдфорда имеет коричневый цвет и синеет при наличии белка.

    Реагенты A и B для метода Лоури

    раствор А: 2% Na2CO3
    раствор В: 0.5% CuSO4*5H2O на 1% цитрате Na


    Комментарии

    Общие

  • У нас в лабе практикуются два самых известных аналитических метода: реакция Мерион Бредфорд [Bradford M.M. (1976) Anal. Biochem. 72: 248-254.] и Лоури. В обоих случаях нужен спектрофотометр. Бредфорд проще и быстрее. По надёжности методы одинаковые. Нужно выбрать для себя какой-нибудь из методов и им пользоваться, а второй держать в голове на случай, если потребуется повторить чужую работу.


  • По пунктам

    Метод Брэдфорда

    п. 4.

  • Кюветы после каждого измерения желательно мыть спиртом, т.к. кумасси сорбируется на стекло и завышает показания.

    Дополнения, комментарии, вопросы

    Гость /09.11.2005 18:45/
    Некоторые наблюдения за раствором...
    Хм, кумасси синеет и при растворении в спирту. Для растворения нужно использовать спирт 95%. Затем добавляем заводскую о-фосфорную кислоту (85%) раствор становится коричневым.
    После доведения до объёма бидистил. водой коричневый раствор вновь приобретает синеватый оттенок. По прошествии 5-7 дней раствор снова становиться коричневым.
    Есть предположение что у каждого своя Бредфорд:)



    0xy /10.11.2005 12:49/
    о-фосфорную кислоту (85%) надо добавлять медленно, по каплям (можно делительную воронку приспособить) и тогда раствор становится не коричневым, а каким положено...и цвет не меняет...wink.gif



    _vectors_ /11.01.2006 02:55/
    к методу лоури, реактив В не стоек и медь сыпется, готовить его перед анализом из растворов В1 (медь) и В2 (цитрат)



    Гость /21.03.2006 16:41/
    а что представляет из себя кумасси? И как его можно получить?



    bukach /21.03.2006 17:48/
    1. гуугле рулит

    2. купить. главное с R не перепутать



    melkij becc /21.03.2006 18:08/
    (Гость @ 09.11.2005 18:45)
    Ссылка на исходное сообщение  Некоторые наблюдения за раствором...
    Хм, кумасси синеет и при растворении в спирту. Для растворения нужно использовать спирт 95%. Затем добавляем заводскую о-фосфорную кислоту (85%) раствор становится коричневым.
    После доведения до объёма бидистил. водой коричневый раствор вновь приобретает синеватый оттенок. По прошествии 5-7 дней раствор снова становиться коричневым.
    Есть предположение что у каждого своя Бредфорд:)

    странно себя ведет кумасся. она простояла достаточное время, неоднократно использовалась для анализа. а тут бац, стала синеть. отливаешь ее в стаканчик сколь надо. еще ничего не добавлял. глядь, она уже не совсем коричневая, что-то синее проклевывается. Ну и как с такой работать?



    bukach /21.03.2006 18:23/
    1. новую сделать (что лучше)

    2. кислоты докапать до покричневения (не знаю что получится, но можно попробовать).

    3. в след раз делать меньше чтоб долго не хранить



    Гость /26.03.2006 16:22/
    Это модификация метода Лоури? В стандартной методике указан тартрат натрия или калия, которого у меня нет. Его действительно можно заменить цитратом?



    Гость /26.03.2006 19:45/
    А вы ничего не пропустили? Концентрация карбоната натрия в реагенте А не должна составлять 20 %, как в оригинальной методике Лоури ? Дайте, пожалуйста, ссылку на какую-нибудь статью с этим методом.



    bukach /27.03.2006 15:29/
    (Гость @ 26.03.2006 16:22)
    Ссылка на исходное сообщение  Это модификация метода Лоури? В стандартной методике указан тартрат натрия или калия, которого у меня нет. Его действительно можно заменить цитратом?

    тартрат нужен для того, чтобы медь в щелочной среде в осадок не выпала. думается, что цитратом заменить его можно. например, в биуретовом реактиве - тартрат, а в реактиве Бенедикта (микробиуретовый метод) - цитрат.

    (Гость)
    Ссылка на исходное сообщение  А вы ничего не пропустили? Концентрация карбоната натрия в реагенте А не должна составлять 20 %, как в оригинальной методике Лоури ? Дайте, пожалуйста, ссылку на какую-нибудь статью с этим методом.


    в оригинальной методике Лоури тоже 2%. можете сами убедиться - статья в открытом доступе http://www.jbc.org/cgi/reprint/193/1/265 ( http://www.jbc.org/cgi/reprint/193/1/265 )



    bukach /27.03.2006 15:35/
    странички из Protein Protocols c методом Лоури
    (с ссылками и модификациями)



    Файл/ы:

    Lowry_from_The_Protein_Protocols_Handbook_Second_Edition_.pdf
    Размер:: 20.05к
    кол-во скачиваний: 19




    Гость /07.05.2006 18:06/
    реактив Бредфорд используется сразу после пригоовления или должен стоять какое то время?



    bukach /10.05.2006 14:55/
    (Гость @ 07.05.2006 19:06)
    Ссылка на исходное сообщение  реактив Бредфорд используется сразу после пригоовления или должен стоять какое то время?


    вполне можно. перед употреблением отфильтровать его желательно. еще стоит учесть, что со временем калибровка может измениться, посему лучшее её каждый раз повторять.



    Гость /19.07.2006 07:05/
    Никто не в курсе в чем заключается принцип окрашивания в обоих методах и от чего оно зависит. А то есть белочек у меня который красится по Лоури, а по Брэдфорд не хочет и из-за этого я на форезе его не вижу, хотя на 280нм дает интенсивный пик при гел-фильтрации



    stanislaff /19.07.2006 10:23/
    Есть еще один нюанс. Брэдфорд очень чувствителен к ацетату и формиату натрия. Я буквально только что делал анализ - по Брэдфорду концентрация протеина аж зашкаливает, а на электрофорезе - полный ноль. Приготовил растворы ацетата и формиата натрия - снова зашкаливает (рН 7-9). Гидроксид и хлорид натрия окрашивания не дают, уксусная кислота - тоже. Грешу на ацетат- и формиат-анионы...



    guest: yMHuK /21.07.2006 18:21/
    (Гость @ 19.07.2006 07:05)
    Ссылка на исходное сообщение  Никто не в курсе в чем заключается принцип окрашивания в обоих методах и от чего оно зависит. А то есть белочек у меня который красится по Лоури, а по Брэдфорд не хочет и из-за этого я на форезе его не вижу, хотя на 280нм дает интенсивный пик при гел-фильтрации

    Coomassie (Bradford) красит избранные аминокислоты, потому результат зависит не только от концентрации, но и от аминокислотного состава. Соответственно, для точной концентрации калибровать нужно или по тому же самому белку, или вводить поправку, если она для Вашего белка известна.
    У Lowry вариации между белками с разным составом раза в 2.5 меньше.
    Выбор между этими двумя обычно определяется совместимостью с детергентами, солями, растворителями, редуцирующими агентами и прочей дрянью в белковом растворе.



    guest: ммм /21.07.2006 18:51/
    Coomassie (Bradford) красит избранные аминокислоты, потому результат зависит не только от концентрации, но и от аминокислотного состава.

    Гы! все еще проще, вообщем кумася красит в основном лизины и аргинины и немного пептидную связь.

    А Лоури больше похож на БСА, хотя это у меня только щас мызль такая прорезалась, раньше я все грешил на тирозины, он неравнодушен к тирозину ибо по жизни реагент фолина используется для обнаружения фенолов.



    Mac-1 /22.07.2006 08:15/
    (stanislaff @ 19.07.2006 03:23)
    Ссылка на исходное сообщение  Есть еще один нюанс. Брэдфорд очень чувствителен к ацетату и формиату натрия. Я буквально только что делал анализ - по Брэдфорду концентрация протеина аж зашкаливает, а на электрофорезе - полный ноль. Приготовил растворы ацетата и формиата натрия - снова зашкаливает (рН 7-9). Гидроксид и хлорид натрия окрашивания не дают, уксусная кислота - тоже. Грешу на ацетат- и формиат-анионы...


    Синяя как раз анионная форма Кумасси. А вы не пробовали добавлять в ваш образец с ацетатом и/или формиатом равный обьем (или больше) 1М NaOH? Посмотрите об этом статью Стошека (Stoscheck) в 182 томе Methods in Enzymology, там где-то в самом начале (нет под рукой сейчас).

    (guest: ммм @ 21.07.2006 11:51)
    Ссылка на исходное сообщение  Coomassie (Bradford) красит избранные аминокислоты, потому результат зависит не только от концентрации, но и от аминокислотного состава.
    Гы! все еще проще, вообщем кумася красит в основном лизины и аргинины и немного пептидную связь.
    А Лоури больше похож на БСА, хотя это у меня только щас мызль такая прорезалась, раньше я все грешил на тирозины,  он неравнодушен к тирозину ибо по жизни реагент фолина используется для обнаружения фенолов.


    Вообще-то, и Бредфорд тоже отчасти неравнодушен к тирозину. smile.gif При Бредфорде Кумасся в связывается в основном с аргинином и в гораздо меньшей степени (примерно в 8 раз меньше) с лизином, а также с ароматическими АК: триптофаном, тирозином, фенилаланином и гистидином (гидрофобные взаимодействия). Так что и здесь триптофан фигурирует. smile.gif

    ----------------------------------------------
    Есть еще такой старинный и забытый сейчас метод: проба с ТХУ. В образец добавляют ТХУ до 10%, вортексируют и меряют мутность раствора, например при 320-340 нм. Калибровочную кривую можно составить по абсолютно любому белку. Метод грубый, не очень точный и не очень чувствительный, но зато он очень прост, нет вариации по белкам, и он совершенно равнодушный к многим добавкам и примесям в буфере и работает там, где и Лоури, и Бредфорд не фурычат. Особо полезен для белковых смесей, на ранних этапах очистки, когда белка много, а калибровки по индивидуальным белкам - ненадежны.



    Vladimir70 /22.07.2006 18:37/
    <Coomassie (Bradford) красит избранные аминокислоты, потому результат зависит не только от концентрации, но и от аминокислотного состава.<



    Правда-правда. У меня тут интересный случаи тоже есть, ИЛ15 и ИФН-бета. Если по тагу считать то ИЛ15 в два раза больше, а на геле, кумасси раза в три интенсивнеее Интерферон красит. Пирсовскии BCA кит согласен с тагом. Прикольно.
    Вот и верь после этого людям.



    guest: yMHuK /24.07.2006 19:45/
    (Vladimir70 @ 22.07.2006 18:37)
    Ссылка на исходное сообщение  Правда-правда. У меня тут интересный случаи тоже есть, ИЛ15 и ИФН-бета.  Если по тагу считать то ИЛ15 в два раза больше, а на геле,  кумасси раза в три интенсивнеее Интерферон красит. Пирсовскии  BCA кит  согласен с тагом. Прикольно.
    Вот и верь после этого людям.

    А всё потому, что и BCA, и Lowry основаны на биуретовой реакции - восстановлении меди в щелочной среде. Для этого достаточно пептидных связей, всякую неразбериху вносят некоторые боковые цепи. И коэффициент вариации для разных беллков у BCA и Lowry весьма похож, и, как я уже писал, заметно ниже Брэдфорда.



    Гость /12.09.2006 17:18/
    А если G заменить R? Пройдёт?



    Афанасий /09.12.2006 19:57/
    1 g G-250 (Serva)
    200 мл фосфорной кислоты
    100 мл этанола

    Это сток. Последний раз готовил года два назад. Работаает как зайка по сей день и не синеет. Я так понимаю, что это практически вечно.

    30 мл стока
    80 мл фосфорной кислоты
    100 мл этанола
    вода до 600 мл (рабочий)

    проба:краситель=1:1,5

    очень удобно ставить в плашках (100+150 мкл)



    guest: ммм /11.12.2006 16:03/
    ---А если G заменить R? Пройдёт?

    Нет!!!!



    Гость /01.03.2007 17:06/
    Если планируете использовать Брэдфорд в течение длительного времени и возможно использование нескольких независимо приготовленных порций, вот рекомендации по стандартизации (опыт добыт потом и кровью): Готовить и хранить в темной посуде или оборачивать фольгой. Сразу после смешивания не фильтровать. Дать отстояться ночь при комнатной температуре, потом профильтровать. Стабилизировать еще несколько дней (7-8 должно хватить), профильтровать вторично. Снять спектр (это чтобы сравнивать со следующими порциями) пустого красителя и с 2-3 концентрациями стандарта. Показатели сильно зависят от температуры, поэтому работать при отклонении температуры больше чем на 3 градуса не рекомендую. Если холоднее - греть помещение. Если теплее, разбавить краситель соответствующим растворителем (этанол/кислота/вода в нужном соотношении). Естественно, учитывая все это, ни в коем случае не совать в холодильник!



    Гость /01.03.2007 17:23/
    Извините, уточнение к предыдущему комментарию:
    Фильтровать нужно 2 раза по такой схеме (желательно иметь мембранный фильтр больше, чем 0.22, а можно и через фильтровальную бумагу в несколько слоев, в зависимости от объема - 1 слой на 200 мл): 1 раз через 15-18 часов после приготовления, второй раз - через сутки. И после этого уже настаивать 7-10 дней в зависимости от температуры. И контролировать динамику на спектрофотометре.



    BDS /01.03.2007 17:46/
    Здравствуйте! У нас такая проблема: Определили концентрацию белка по методу Лоури, полученные показания были достаточно равномерны и укладывались в рамки калибр. графика. После этого провели ПААГ электрофорез по Лэмли и обнаружили, что белковые треки совсем не выровненны (часть полос очень темные, часть светлые, часть окрашены неравномерно: сверху светлые, снизу темные), хотя на каждый трек наносилось строго определенное количество белка, рассчитанное по Лоури. Суть проблемы в том, что белок был выделен не нами и по совсем другой методике, тогда как выделенные нами белки всегда прекрасно выравнивались, исходя из Лоури, и с ними никогда не было таких проблем.
    Сталкивался ли кто-нибудь с подобным, с чем это может быть связано, и как нам выровнять белок, чтобы полученные после Вестерн Блоттинга результаты были достоверны.
    Заранее спасибо.



    guest: ммм /01.03.2007 19:52/
    Лоури чувствителен к востанавливающим вещества DTT MЭ Тритон фенол.

    Но то что описываете вы больше всего похоже на плохую окраску геля кумасси, у вас было плохое пермешивание или плохо гель в ваночке болтался, но я бы аккуратно перекрасил бы гель для начала.

    В принципе белок можно выровнять прямо по гелю. Либо на глаз, либо взять скан геля обсчитать его с помощью какой нибудь проги.

    Еще мложно опробовать другие методы: BCA и Брэдфорд.

    А еще есть чудная хрень: кумася на фильтровашке хороша тем что белок сорбируентся на бумаге а потом отмывется от всех модулирующих примесей.

    http://molbiol.ru/protocol/17_05.html ( http://molbiol.ru/protocol/17_05.html )



    Лидия Боровкова /02.03.2007 12:14/
    Вопрос к Афанасию по поводу стока. При приготовлении реактива Бредфорд из вашего стока мы получаем более концентрированный вариант, чем в классической прописи. Это сделано по каким-то особым соображениям?



    Гость /19.03.2007 16:19/
    Народ, напомните, пожалуйста, относительно чего проводят калибровку: относительно того в чем растворен белок или относительно вода+Кумасси (без белка)?



    bukach /20.03.2007 00:10/
    (Гость @ 19.03.2007 16:19)
    Ссылка на исходное сообщение  Народ, напомните, пожалуйста, относительно чего проводят калибровку: относительно того в чем растворен белок или относительно вода+Кумасси (без белка)?


    вы, наверное, имеете ввиду нулевую точку на калибровке?
    лучше то, в чём растворён белок.



    Афанасий /26.03.2007 19:13/
    2 Лидия Боровкина

    В целом, чувствительность плавает от соотношения белок/краска.
    Больше Кумасси - меньше белка засекает.
    Вот и все соображения.



    Лидия Боровкова /27.03.2007 09:44/
    (Афанасий @ 26.03.2007 19:13)
    Ссылка на исходное сообщение  2 Лидия Боровкина

    В целом, чувствительность плавает от соотношения белок/краска.
    Больше Кумасси - меньше белка засекает.
    Вот и все соображения.




    Лидия Боровкова /27.03.2007 09:49/
    Большое спасибо, Афанасий. Поскольку вы такой продвинутый в этом вопросе посоветуйте стоит ли обращать внимание на температуру в помещении и где можно заказать стандартный белок что-то типа гамма-глобулина по сходной цене?



    Гость /04.05.2007 09:53/
    Привет кто нибудь может поделиться с методикой выделения белка для последующего анализа методом Бредфорда.



    Гость /25.07.2007 12:24/
    Привет. Подскажите пожалуйста, приготовил раствор Бредфорда, а он жёлтый. Готовил так: 100мг кумасси G-250 растворил в 50ml спирта и добавил 100ml ортофосфорной кислоты, довёл до 1л водой и профильтровал.



    guest: ммм /25.07.2007 12:59/
    Чиста, конкретно желтый, например, как желтая акварельная краска или раствор фурацилина или пикриновой кислоты? или не синий?

    Если чиста желтый, то либа кумаси был не кумаси, а например БФС.
    Либо спирт не спирт
    Либо кислота не кислота.



    Яра /20.08.2007 22:35/
    (Афанасий @ 26.03.2007 20:13)
    Ссылка на исходное сообщение  

    В целом, чувствительность плавает от соотношения белок/краска.
    Больше Кумасси - меньше белка засекает.
    Вот и все соображения.

    Совсем недавно валидировала методику Бредфод для нашей лабы. Как ни странно - больше кумасси засекает больше белка. В моем случае удвоение концентрации красителя и смена этанола на метанол позволила стабильно определять белок в количестве 1.5 мкг\мл, т.е. чувствительность метода повысилась примерно на порядок.



    guest: Olga /04.09.2007 15:35/
    Крик о помощи знающим людям!
    Для снятия белка с колонки хочу использовать детергент SDS 0,1 - 0,5%. По Бредфорду SDS сам интенсивно окрашивается (р-р Бредфорда готовый покупной), невозможно построить калибровку, что уже говорить о белке. Пыталась сделать калибровку при А280, меньше 30-40 мкг/мл не улавливается, а нужно определять концентрацию от 1 мкг/мл. А еще ерунда получается, когда одно и то же известное количество БСА, растворенное в дистилляте, измеряю при А280 получаю одну концентрацию, а по Бредфорду выходит другая (к исходной концентрации ближе первый метод). Возможно Бредфорд используют для малых концентраций, но хочется ведь проверить, чего я там насчитала. Метод Лоури никогда не пробовала и не знаю как отреагирует SDS.
    Заранее, спасибо!



    guest: ммм /05.09.2007 15:40/
    ---Пыталась сделать калибровку при А280, меньше 30-40 мкг/мл не улавливается, а нужно определять концентрацию от 1 мкг/мл.

    среднее на круг поглощение белка на 280нм А=1 при 1мг/мл так что ниче удивительного.

    --По Бредфорду SDS сам интенсивно окрашивается (р-р Бредфорда готовый покупной), невозможно построить калибровку, что уже говорить о белке.

    Известный фахт.

    -- А еще ерунда получается, когда одно и то же известное количество БСА, растворенное в дистилляте, измеряю при А280 получаю одну концентрацию, а по Бредфорду выходит другая (к исходной концентрации ближе первый метод).

    А совпадение концентраций зависит от того по какому белку вы калибровали Брэдфорд. Если по БСА, то должен совпадать в пределах ашипки.

    --Возможно Бредфорд используют для малых концентраций, но хочется ведь проверить, чего я там насчитала.

    Кривая брэдфорд обычно теряет линейность в районе 8-15 мкг белка на мл раствора Брэдфорд, при длине оптического пути 1см.

    ---Метод Лоури никогда не пробовала и не знаю как отреагирует SDS.
    Вроде никак.

    Есть еще крутой метод BCA(буквы латинские) от Pirce он чувствительнее Лоури и чуть чувствительнее(не намного) Брэдфорд, но нечувствителен к SDS.

    Зато Лоури и BCA чувствительны к хелаторам Типа ЭДТА, Цитрат, Роданид(изотиоцианат), И к востановителям типа фенол, ДТТ, бета-МЭ. Лоури еще чувствителен к тритону.



    guest: ммм /05.09.2007 15:44/
    --но хочется ведь проверить, чего я там насчитала.

    А развести стандартный раствор до более низких концентраций, вам вера не позволяет.



    Гость /07.09.2007 09:13/
    Люди, очень нужен совет.
    Хочу посмотреть содержание белка (то бишь и не белок вовсе, как я понимаю, а скорее уже полипептиды и маленькие пептиды) в мясных гидролизатах. Какой метод лучше использовать: Лоури или Брэдфорд или что-то уж совсем другое?
    Насколько я знаю, Лоури определяет только пептиды не меньше 3-х аминокислот, а мне бы по максимуму определить...



    guest: ммм /07.09.2007 13:29/
    --Хочу посмотреть содержание белка (то бишь и не белок вовсе, как я понимаю, а скорее уже полипептиды и маленькие пептиды) в мясных гидролизатах. Какой метод лучше использовать: Лоури или Брэдфорд или что-то уж совсем другое?
    Насколько я знаю, Лоури определяет только пептиды не меньше 3-х аминокислот, а мне бы по максимуму определить...

    Нингидрин.



    guest: SOTO /02.10.2007 15:11/
    wall.gif Не могу сделать колибровку по Бредфорд для 2-50мкг/мл белка(BSA). Краситель доисторический - возможно нада перекристализировать или покупать новый... Спектры, как на меня, неудовлетворительные.
    Если не в лом то вышлите мне спектр раабочево раствора без белка для сравнения... brykovvasja@gala.net



    bukach /02.10.2007 23:24/
    (guest: SOTO @ 02.10.2007 16:11)
    Ссылка на исходное сообщение  wall.gif Не могу сделать колибровку по Бредфорд для 2-50мкг/мл белка(BSA). Краситель доисторический - возможно нада перекристализировать или покупать новый... Спектры, как на меня, неудовлетворительные.
      Если не в лом то вышлите мне спектр раабочево раствора без белка для сравнения... brykovvasja@gala.net


    для микроопределения (100 мкл белка + 1 мл раствора кумасси) чувствительность 1-10 мкг (т.е. 10-100 мкг/мл). это раз. дело может быть не в самом кумасси, а в фосфорной кислоте. это два. если краска синеватая, а не коричневая, то и без спектров понятно, что неправильная. и что значит "не могу сделать"?
    да, и БСА для Бредфорд лучше не использовать.



    guest: SOTO /05.10.2007 15:19/
    "не могу сделать" - оптическая плотность при 50мкг/мл белка в раене 2.0 (0.5 мл раствор белка + 2.5 мл красителя)



    guest: ммм /08.10.2007 13:27/
    ---"не могу сделать" - оптическая плотность при 50мкг/мл белка в раене 2.0 (0.5 мл раствор белка + 2.5 мл красителя)

    Либо остановитесь на 35 мкг, либо бухните мл 5-10 фосфорной в ваш Брэдфорд, только потом не жалуйтесь, что у вас чувствительность упала.



    guest: Soto /11.10.2007 19:17/
    Продолжая свои мучения по Бредфорду возникли некоторые вопросики... Какой вид имеют спектры чистого красителя и комплекса с белком? они имеют форму выраженого пика или всё-же растянутого плато без чётко выраженого плато? Есть подозрение, что краситель не достаточно очищен или просто цже негодный для использования.... И как влияет степень читоты фосфорной кислоты на процес прохождения реакции между красителем и белком?



    guest: ммм /11.10.2007 19:38/
    --они имеют форму выраженого пика или всё-же растянутого плато без чётко выраженого плато?

    я не снимал эти спектры, но по моему мнению они должны иметь форму размытого(возможно сильно) пика, а плато это скорее вопрос к прибору чем к спектру.

    --Есть подозрение, что краситель не достаточно очищен или просто цже негодный для использования...

    Товарисчь у вас есть градуировачная кривая, да она не идеальна, дело возможно в красителе, но скорее всего нет, ибо если краситель грязный, то у вас скорее всего вообще ничего не получится даже раствор нормальный не приготовите.

    -- И как влияет степень читоты фосфорной кислоты на процес прохождения реакции между красителем и белком?

    Давайте без обяснений механизмов, а только эмпирику. Кислота способствует образованию коричневой формы красителя, чем ее больше тем тяжелее белку связать краситель в синий цвет. Если кислоты мало то исходный краситель имеет сильную синезеленую опалесценцию. А градуировчная кривая очень крутая с коротким линейным отрезком и быстро выходит на плато. Если кислоты много то раствор сильно коричневый и не имеет осинезеленой опалесценции, а градуировачная кривая пологая и сохраняет линейность до довольно высокой концентрации белка, но зато снижается ее чувствительность вплоть до полного отсутствия.
    Известно что фосфорная кислота склонна всасывать в себя воду, кроме того фосфорная кислота может иметь разную концентрацию и в товарном виде, пропись же раствора Брэдфорд написана для 85% кислоты, если в исходном растворе концентрация кислоты отличается от это цифры, возможны траблы.

    И еще одно замечание по поводу:

    --0.5 мл раствор белка + 2.5 мл красителя

    Очень большое разведение исходного раствора Брэдфорд, а следовательно и снижение концентрации кислоты. Обычно вносят 1/20 -1/10 от раствора Брэдфорд.



    Гость /19.10.2007 13:24/
    Как же всё-таки мерять концентрации спо Брэдфорда?
    Считать кол-во аргининов и лизинов в калибровочном белке и опытном? В моём белке например аргининов всего 6. И если считать так, то его концентрация просто офигеть. Судя по форезу, это совсем не так. И кстати, какие именно остатки красит R-250?



    guest: ммм /19.10.2007 16:16/
    ---Как же всё-таки мерять концентрации спо Брэдфорда?

    Считать кол-во аргининов и лизинов в калибровочном белке и опытном? В моём белке например аргининов всего 6.
    Да, нет, надо просто калибровать по своему белку. wink.gif shuffle.gif

    -- И если считать так, то его концентрация просто офигеть.
    Судя по форезу, это совсем не так.
    Надо учитывать их количество на мол. вес tongue.gif
    Не заморачивайся обычна ошибка не достигает величины более 50% - 100% jump.gif

    И кстати, какие именно остатки красит R-250?

    Он не годится в Брэдфорд, а красит тоже самое. А в форезе он очень быстро достигает насыщения на градуировочной кривой.



    kletka /24.10.2007 14:14/
    для Эмин. "Размытый пик" для комплекса с белком, или для чистого красителя?



    Гость /02.11.2007 07:32/
    Определяла содержание белка в образцах выделенных митохондрий двумя методами - Бредфордом и Лоури. Калибровку по Брэдфорду проводила по гамма глобуллину (все реактивы Bio-Rad), а по Лоури - ВСА. результаты измерения содержания белка в одних и тех же образцах, полученные двумя методами, абсолютно не совпадают. нет никакой связи... Например, по Бр. в 1 - 16 мкг/мкл, 2 - 48, 3 - 54; а по Лоури в тех же: 1 - 22, 2- 20, 3 - 49. Видимо, дело в различии м/у двумя методами (Бр. - основные и ароматические ак, а Лоури - пептидная связь), а также в том, что для калибровки используются разные белки...



    guest: ммм /02.11.2007 11:18/
    Градуировать Брэдфорд по гамма-глобулину еще большая ошибка чем по BSA. Там офигенное занижение по сравнению с градуировкой по БСА раза в 3 в 4

    --Бр. - основные и ароматические ак, а Лоури - пептидная связь

    Все не совсем так Брэдфорд тоже частично реагирует с пептидной связью(иначе он не был бы красителем для шелка, а Лоури вовсю реагирует с тирозином, метионином и цистинами(цистеинами).



    guest: Гость /07.11.2007 16:15/
    Люди добрые, помоготе. Нужно по Бредфорду определить общую концентрацию пептидов в экстракте (все пептиды до 25000 Да). Не знаю по какому белку или пептиду строить калибровку. Так, чтобы и недорого было, и эффективно. rolleyes.gif



    guest: ммм /07.11.2007 18:48/
    --Не знаю по какому белку или пептиду строить калибровку. Так, чтобы и недорого было, и эффективно.

    1) По BSA/OVA и забить на все.
    2) Берете ваш образец и диализуете его до победы с мембраной 10кДа против летучего буфера(низкой концентрации не более 20мМ) типа ацетат(формиат) пиридиния(аммония). Потом победно(несколько раз) лиофильно сушите во взвешенной таре. Узнаете вес сухого образца по нему колибруете Брэдфорд.
    3) Все тоже самое, что и (2), но из тотального белкового экстракта вашего объекта.



    Guest /07.12.2007 19:35/
    Здравствуйте! Вопрос: кто-нибудь делал раствор по Брэдфорт с хлорной кислотой? Он вроде более устойчив, чем со спиртом и фосфорной кислотой. И еще, вроде по данной методике оптическая плотность чистого раствора должна находится в р-не 1,3-1,5, а у меня она только 0,6. Будет ли это влиять на определение белка?



    guest: ммм /09.12.2007 14:46/
    --кто-нибудь делал раствор по Брэдфорт с хлорной кислотой?
    Я, нет.

    --И еще, вроде по данной методике оптическая плотность чистого раствора должна находится в р-не 1,3-1,5, а у меня она только 0,6.

    По какой методике и кем данной. Оптическая плотность? На какой длине волны?

    А еще я люблю остатки отюзанного Брэдфорд из кюветы на фильтровашку промокать. Если такое сделать с хлорной кислотой, то можно пожар устроить.



    Guest /10.12.2007 09:14/
    --По какой методике и кем данной. Оптическая плотность? На какой длине волны?--
    "Методы очистки белков" Скоупс. Длина волны - 465 нм.



    guest: ммм /10.12.2007 20:48/
    ---"Методы очистки белков" Скоупс. Длина волны - 465 нм.
    Угу! Ну что я могу сказать по этому поводу. Например, величина приведена для не разбавленного в 2 раза реактива. Как написано в методике при измерении холостая проба фактически разводит реакитив в два раза, возможно вы измеряли разведенную пробы, а надо было не разведенную. Весы у вас возможно врут и там не 60мг. Кювета с длинной пути 0.5см вместо 1-ого. Ну и еще в книжке может быть опечатка и длина волны не та. Так что я бы попробовал в первоисточник глянуть Analytical Biochemistry v86 p.142;v79 p.544



    guest: ммм /10.12.2007 21:11/
    еще реактивная хлорная кислота не бывает 100%, может вы ее за таковую приняли и недолили кислоты.



    guest: Гость /30.01.2008 22:52/
    Определяю общее содержание белка по Брэдфорду, в растворимой белковой фракции (белок, трис-HCl-буфер, MgCl2, ЭДТА) выпадает осадок. Меняла кислоту, краситель - все равно выпадает. Причем в мембраносвязанной белковой фракции меряется нормально. Подскажите пожалуйста с чем это может быть связано.



    guest: ммм /31.01.2008 13:27/
    --Подскажите пожалуйста с чем это может быть связано.
    Магний дает с фосфорной кислотой малорастворимые и нерастворимые фосфаты.



    Гость /20.03.2008 09:38/
    Здравствуйте! При попытке построить график концентрации белка для анализа по Бредфорд столнкулся с тем, что БСА (Сигмовский) при концентрациях выше 0,8 мг/мл в реактиве сворачивается. Кто-нибудь может посоветовать, на чём лучше строить график? Грубо говоря, какой белок растворим при низких рН? Определяемое вещество - иммуноглобулины, безумно дороги, строить на них график - нереально.



    Guest /20.03.2008 12:08/
    да не работайте при концентрациях выше 0.5 мг/мл, разбавляйте растворы!



    guest: ммм /20.03.2008 14:24/
    0,8 мг/мл - это конечная в Брэдфорде. Тогда ничего удивительного у меня уже при 30-50мкг/мл начинается зашкал и нелинейность. Если же просто капнуть несколько мкл БСА с концентрацией 1мг/мл ничего в осадок не выпадает (Ну вообще то выпадает часика через 3-4) у меня БСА сигмовский V-ая фракция.

    Похоже у вас фиговое качество кумаси.

    Далее: Иг дают на брэдфорде заниженный результат, если его калибровать по БСА раза в 1.5-2.

    Так что вам по любому БСА неподходит. Купите препарат общий(неспецефичный) имуноглобулинов того же зверя, что и ваши супер пупер антитела. Он сравнительно недорогой более того грубую фракцию ИгG легко самим просто выделить высаливанием сульфатом аммония из сыворотки крови.

    Да, и считатется, что 1мг/мл ИгG на 1см на длине волны 280нм дает экстинцию порядка 1.35-1.45.



    А /24.03.2008 20:37/
    И что взять вместо БСА, если Ig не интересуют?



    А /24.03.2008 20:39/
    (Эмин @ 20.10.2007 14:52)
    Градуируйтесь по своему белку.

    И как это сделать, если коммерческих препаратов не существует, а до гомогенности еще не почистили?



    А /24.03.2008 20:40/
    Кстати, а ЧСА как?



    guest: ммм /25.03.2008 17:35/
    --И что взять вместо БСА, если Ig не интересуют?

    БСА и взять, хотите подороже возмите OVA.

    --И как это сделать, если коммерческих препаратов не существует, а до гомогенности еще не почистили?

    Никак. Что вы в таком случае измерять собираетесь. Смесь белков у каждого своя сорбция краски, для градуировки годится любой стандарт с известной концентрацией тотального белка. Естественно абсолютную концентрацию вы в любом случае будете измерять с некоторой не катастрофичной ошибкой. Зато относительную более менее корректно.

    --Кстати, а ЧСА как?

    Никак, так же как БСА.



    Гость /25.04.2008 16:21/
    Здравствуйте!
    Такой вопрос.
    Приготовили раствор кумасси G-250 для Брэдфорд (все строго по прописи: 100 мг кумасси да в 50 мл 95% спирта да в 100 мл 85% фосфорной и водой до 1 л), а он, зараза, не такой получчается, каким мы его хотим видеть. Ночь стоял, но даже после этого после фильтрации не то чтобы коричневым получился, а каким-то болтно-зеленым. Пробовали строить по нему калибровку по БСА, а там показатели что для 0.8 мг-1.4, что для 70 мкг-1.22. Калибровка в итоге префиговая.
    Есть подозрения по поводу фосфорной кислоты, что она вовсе не 85%, а чуть ниже. Хотелось бы узнать ее плотность при 20-25 С и проверить концентрацию, а справочника под рукой нет (и денсиметра нужного тоже). Подскажите пожалуйста цифрки! Заранее пасиб!



    guest: ммм /25.04.2008 17:54/
    --Есть подозрения по поводу фосфорной кислоты, что она вовсе не 85%, а чуть ниже.

    Абсолютно правильные предположения.

    -- Подскажите пожалуйста цифрки! Заранее пасиб!

    1.684-85%
    1.630-80%
    1.655-82.5%



    Гость /27.08.2008 19:20/
    Здравствуйте! Подскажите, пожалуйста, можно ли откалибровать "Бредфорда" по пероксидазе для определения ее же самой, притом, что она экстрагирована натрий-фосфатным буфером РН=6? Или надо покупать препарат?
    И еще: Что такое БСА? Это покупается или готовится?



    guest: ммм /27.08.2008 19:50/
    --Подскажите, пожалуйста, можно ли откалибровать "Бредфорда" по пероксидазе для определения ее же самой,
    Можно.
    --притом, что она экстрагирована натрий-фосфатным буфером РН=6?
    Это нормально буфер подходящий, только вам должна быть известна ее концентрация, определенная независимым методом типа(что там 430/280) или какой то другой способом. Собственно пероксидаза мерятся по собственной окраске, зачем ей Брэдфорд непонятно.
    --И еще: Что такое БСА? Это покупается или готовится?
    Бычий Сывороточный Альбумин.
    Купить сухой проще. Сделать самому раствор.



    Гость /28.08.2008 17:46/
    Спасибо большое Вам ммм!А нужно это для того, чтобы в формулу пересчета активности фермента подсавлять уже количество белка, определенного по Брэдфорду, а не показания оптической плотности окрашенного ОФД. Умные люди говорят, что так, мол, точнее результат



    guest: ммм /28.08.2008 18:56/
    Еще раз повторяю, что для калибровки вам нужен образец с заранее известной концентрацие пероксидазы. Даже если у вас есть лиофилизированный порошок и вы его собрались взвешивать его надо подсуить прерд взвешиванием в вакууме при температуре 50-60 градусов(возможно это убет ее, как фермент но сохранит окраску в брэдфорде.

    По Сигме(Delincee, H. and Radola, B.J., Eur. J. Biochemistry, 52, 321–330, 1975.) 1мМ(44мг/мл) пероксидазы на 403 нм дает поглощение 100 единиц/см

    Возможно вам не нужен Брэдфорд, а для определния количества пероксидазы просто измерять поглощение на 403нм. Ну и еще учитыват поглощение на 275нм.



    michael1987 /17.11.2008 22:13/
    ______

    Давайте без обяснений механизмов, а только эмпирику. Кислота способствует образованию коричневой формы красителя, чем ее больше тем тяжелее белку связать краситель в синий цвет. Если кислоты мало то исходный краситель имеет сильную синезеленую опалесценцию. А градуировчная кривая очень крутая с коротким линейным отрезком и быстро выходит на плато. Если кислоты много то раствор сильно коричневый и не имеет осинезеленой опалесценции, а градуировачная кривая пологая и сохраняет линейность до довольно высокой концентрации белка, но зато снижается ее чувствительность вплоть до полного отсутствия.
    Известно что фосфорная кислота склонна всасывать в себя воду, кроме того фосфорная кислота может иметь разную концентрацию и в товарном виде, пропись же раствора Брэдфорд написана для 85% кислоты, если в исходном растворе концентрация кислоты отличается от это цифры, возможны траблы.
    _____

    Дополнения к данной теме. Эмпирика процесса как раз очень интересная. Я 2 дня промучился с получением раствора Бредфорд правильной. Теперь, зная немного процесс могу дать совет правильного приготовления раствора в 99% случаев :). Для начала Кумаси Р и Г по химизму сходны. Р отличается от Г только двумя метилированными остатками, отсюда его чувствительность по связыванию с белками ниже на порядок. Много препаратов Кумаси есть "грязными" по природе :), кроме того Кумаси сам плохо растворяется. Поэтому при растворении в кислоте о дает коричневый цвет за счет образования коллоидных частиц в кислой среде. При доведении смеси дистиллятом до нужного соотношения скорее всего коричневого цвета вы никогда не получите. Я не получил еще :). В лучшем случае капая понемногу можно получить сине-зеленоватый цвет, что отображает изменения коллоидного раствора. В большинстве случаев цвет будет грязно-синий или синий, и это мало чем зависит от "белков вокруг вас" (я вот когда готовил по локти был в этаноле) :). Правда это не совсем так, и я советую все вымывать спиртом для чистоты реактива. Но под конец синий оттенок в большинстве случае стерильного приготовления реактива обуславливается наличием взвеси частиц нерастворившиегося Кумаси. Перед доливанием дистилята раствор концентрирован, по мере разбавления коричневый цвет становится слабее и синева становится все заметнее, между коричневым и синим возникает ряд переходящих оттенков, включая зеленый, салатовый и др. (она была и в начале, просто не заметна при коричневой окраске). Полученный синий реактив легко превращается в коричневый при удалении не растворившегося реактива путем фильтрования (подойдет любой чистый кусок ватмана). После фильтрования вы получаете чистейший и прозрачнейший раствор коричневого цвета. ВОт он уже будет синеть при наличии белков очень заметно. При приготовлении и встряхивания раствора должна появляться легкая пеннистость. Это значит, что как минимум посуду вы познакомили со спиртом, так как не следует забывать, что смеси воды со спиртом (даже маленькой концентрации) уменьшают поверхностное натяжение и способствуют образования пенистой структуры воды. Реактивы лучше готовить в стеклянной посуде, так как с пластиком Кумаси прочно связывается и очень тяжело вымывается. Для экономии этилена, предварительно можно промыть посуду и кюветы пропиловым спиртом или другим, менее дефицитным. После каждого измерения обязательно промыть спиртом кювету, особенно это касается пластиковым кювет - без этого линейности калибровки вы никогда не получите. Вот в принципе и все. Если повторять все вышеописанное, реактив всегда будет одинаковый как и результаты. Удачи!



    michael1987 /17.11.2008 22:17/
    _____

    Еще раз повторяю, что для калибровки вам нужен образец с заранее известной концентрацие пероксидазы. Даже если у вас есть лиофилизированный порошок и вы его собрались взвешивать его надо подсуить прерд взвешиванием в вакууме при температуре 50-60 градусов(возможно это убет ее, как фермент но сохранит окраску в брэдфорде.
    ____

    Мы практиковали еще просушку белка для калибровки в роторном испарителе :) (навеску вдвое большую, чем надобно, помещали в фольгу и плотно заматывали, примеси туда при сушке почти не попадают, а водяная пара хорошо оттягивается через микрощели в фольге). Довольно неплохо получается. Легкий вакуум, 30 градусов, 40 минут - красота.



    michael1987 /17.11.2008 22:22/
    _____
    Известно что фосфорная кислота склонна всасывать в себя воду, кроме того фосфорная кислота может иметь разную концентрацию и в товарном виде, пропись же раствора Брэдфорд написана для 85% кислоты, если в исходном растворе концентрация кислоты отличается от это цифры, возможны траблы.
    _______

    Кстати, необязательно использовать именно 85% кислоту. Нужно пересчитать, какая в конечном растворе концентрация кислоты и исходить из этого. Правда это проверено для кислот с концентрацией 85 и более процентов. Я готовил из 95% кислоты. Если процент кислоты больше 85, то ее нужно брать меньше, а недостающий объем заменять водой, то есть, разводить прямо в реактиве. При кислоте меньше 85%, нужно брать больше килоты и меньше воды. Главное чтобы процент кислоты в конечном растворе не изменялся.



    Гость /06.12.2008 15:47/
    я так полагаю, что для определения общего белка в сыворотке крови мне ни один из этих методов не подойдет, т.к. калибровка по БСА неадекватна. Как же померить общий белок и изменения его количества?



    guest: ммм /11.12.2008 21:19/
    --я так полагаю, что для определения общего белка в сыворотке крови мне ни один из этих методов не подойдет, т.к. калибровка по БСА неадекватна. Как же померить общий белок и изменения его количества?

    Нет, эту проблему можно обойти. Внеся попавочный коэфициент. Кроме того чуть ли не 90% сывороточного белка - альбумин ошибка любого метода такова, что на его фоне определить колебания концентрации других белков нетривиальная задача. А раз там албуми основной белок, то калибровка по альбумину будет одной из самых адекватных. Так что я вообще не понимаю смысл мерить колебания общего белка в сыворотке.



    Гость /05.02.2009 22:45/
    помогите - какой процент белка в клетках молонокислых микроорганизмов?



    Крыска /19.02.2009 14:07/
    Процент белка никто никогда не считает, хотя бы потому что основную часть веса/объема составляет вода, а ее количество варьирует достаточно сильно. Считают сухой вес, а белок составляет примерно 50% этого самого сухого веса.



    studenttka /28.02.2010 12:50/
    Здравствуйте всем! Напишите, пожалуйста, кто обсчитывал блоты и форезы (белковые) с целью количественного определения и распределения белка в дорожке и в полосе. Я пытаюсь это сделать с помощью LabImage 1D Kapelan, но в доступной демо версии нельзя (или я не могу?) проанализировать свои гели и блоты, так как их нельзя загрузить...Не знаю, что делать. Помогите, пожалуйста!!!!



    Эмин /28.02.2010 13:33/
    Попробуйте ImageJ. Это простая программа и разобраться в ней не сложно.
    http://rsbweb.nih.gov/ij/ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ )



    wwwmol /01.03.2010 12:31/
    А вот все так уверено говорят про окраску петидной связи. А что это собственно значит?



    guest: studenttka /10.03.2010 15:28/
    To Эмин: Спасибо. Я воспользовалась OptiQuant - просто и быстро:)



    ksm /10.03.2010 15:51/
    пептидная связь - C-N - между аминокислотами в белке. т.е. истинно колличественными являются методы в которых окрашивается именно она



    katsu /14.10.2010 23:50/
    Люди! Человеки! Что вы мучаетесь? Мы в нашей лабе успешно определяем белок по прямому поглощению пептидной связи: 200-215 нм (выбирайте любую длину волны).

    Преимущества:
    1.никаких красителей и грязи,
    2.белок нативен,
    3.чувствительность в 0,01-0,1 мг/мл (в 10 р больше Бредфорд)
    4."видит" хоть двух аминокислотные пептиды
    5."видит" пептиды и белки с любым аминокислотным составом (а не как Бредфорд, который например не видит глутатион, потому что в нем нет лизина)

    Сама лично определяла в пробах методом Бредфорд и спектрофотометрическим при 205 нм: числа идут абсолютно параллельно, только при 205 они выше, так как Бредфорд не "видит" много белков и пептидов

    Могу дать ссылки если надо



    gest /15.10.2010 05:53/
    (katsu @ 14.10.2010 23:50)
    Ссылка на исходное сообщение  Люди! Человеки! Что вы мучаетесь? Мы в нашей лабе успешно определяем белок по прямому поглощению пептидной связи: 200-215 нм (выбирайте любую длину волны).

    Преимущества:
    1.никаких красителей и грязи,
    2.белок нативен,
    3.чувствительность в 0,01-0,1 мг/мл (в 10 р больше Бредфорд)
    4."видит" хоть двух аминокислотные пептиды
    5."видит" пептиды и белки с любым аминокислотным составом (а не как Бредфорд, который например не видит глутатион, потому что в нем нет лизина)

    Сама лично определяла в пробах методом Бредфорд и спектрофотометрическим при 205 нм: числа идут абсолютно параллельно, только при 205 они выше, так как Бредфорд не "видит" много белков и пептидов

    Могу дать ссылки если надо


    Жесть!!! Так можно мерить только в относительно чистых р-рах белка. Знаете, в аналитике есть такая хреновина, называется влияние матрицы? Так вот на 215, а особенно на 200 будет поглощать фигова туча соединений, многие из которых будут это делать сильнее, чем белок.



    katsu /15.10.2010 17:39/
    Я вам говорю, я уже два года измеряю гомогенаты рыб после ультрацентрифугирования, и не просто так, а двумя методами одновременно (я сама очень недоверчива). Получается одна и таже динамика (то есть при введении коэффициента пересчета вы получите абсолютно теже числа, что и Бредфордом).

    Это значит, что если что-то и поглощает в этом диапазоне (кстати, что?), то это уровень этого вещества в тканях столь же константен как и сам белок, а значит, даже с этим допущением эти цифры можно использовать для определения скажем относительной активности фермента в пересчете на белок.



    guest: ммм /15.10.2010 19:45/
    --кстати, что

    Практически все, карбонаты, фосфаты, мочевина, ацетаты, бораты, трис, ацетон, аминокислоты, мочевина, формалин и тд



    Guest /16.10.2010 09:15/
    (katsu @ 15.10.2010 17:39)
    Ссылка на исходное сообщение  Я вам говорю, я уже два года измеряю гомогенаты рыб после ультрацентрифугирования, и не просто так, а двумя методами одновременно (я сама очень недоверчива). Получается одна и таже динамика (то есть при введении коэффициента пересчета вы получите абсолютно теже числа, что и Бредфордом).


    Сочувствую. Вы уже два года измеряете в гомогенатах концентрацию хрен-знает-чего на 200-215 нм, наивно полагая, что измеряете концентрацию белка, да еще и двумя методами. Какими, кстати? И в гомогенатах чего? Надеюсь не икры?

    (katsu @ 15.10.2010 17:39)
    Ссылка на исходное сообщение Это значит, что если что-то и поглощает в этом диапазоне (кстати, что?), то это уровень этого вещества в тканях столь же константен как и сам белок, а значит, даже с этим допущением эти цифры можно использовать для определения скажем относительной активности фермента в пересчете на белок.

    Как Вам уже сказали, очень много всего. Кстати, Ваш вопрос ("кстати, что?) очень красноречив. Без обид. Вы плохо представляете себе физическую сущность аналитических методов, которыми пользуетесь.

    Вообще, мое ИМХО, измерение активности фермента в пересчете на белок в биосубстратах - это часто бессмысленная, но прочно устоявшаяся в биологии процедура. Мое предположение, что она перетекла в биологию из биохимии, где принято мерить удельную активность фермента в процессе очистки. Ну, в самом деле. Вы, к примеру, меряете активность фермента в гомогенате из хрен-знает-чего. В этом гомогенате, фермент составляет жалкую долю процента от всего белка. Поэтому можно просто тупо мерить активность в пересчете на вес того, что вы берете для гомогенизации. Главное, все делать единообразно.



    katsu /22.10.2010 22:38/
    в гомогенатах жабр, печени, почек и мышц плотвы, щуки и сига



    katsu /22.10.2010 22:40/
    нет, на сырой вес пересчитывать нельзя, потому что содержание воды может сильно кол***ся в навеске. Можно пересчитывать на сухой вес, но трудно. Можно на ДНК - еще труднее.
    А пересчитывать на что-то надо, ибо каждая индивидуальная навеска нет-нет да и отличается по разбавлению и проч. в силу чисто технических причин.

    Я спрашиваю "кстати что?", потому что другие крупные биоорганические молекулы в этом диапазоне не поглощают. А остальные очевидно находятся в клетке на постоянном уровне, что и подтверждают мои данные о строгой параллельности данных полученных Бредфорд и по оптическому поглощению.



    Guest /26.10.2010 13:35/
    (katsu @ 22.10.2010 22:40)
    Ссылка на исходное сообщение  
    Я спрашиваю "кстати что?", потому что другие крупные биоорганические молекулы в этом диапазоне не поглощают.


    Поглощают-поглощают, еще как. А еще очень много мелких молекул - гораздо сильнее (есть такая хрень - молярная экстинкция, а еще - закон Бугера-Ламберта-Бера).



    katsu /01.11.2010 15:08/
    Я что-то не понимаю, а почему нет претензий к методу определения белка по спектрофотометрическому поглощения при 260-280 нм, где уж точно поглощают нуклеиновые кислоты и проч, и только некоторые аминокислоты, и который активно используется в УФ-детекторах при хроматографии?

    А наш метод (довольно давно, кстати известный) более точен и с теоретической точки зрения и как я утверждаю с практической!



    guest: ммм /01.11.2010 17:18/
    --Я что-то не понимаю, а почему нет претензий к методу определения белка по спектрофотометрическому поглощения при 260-280 нм, где уж точно поглощают нуклеиновые кислоты и проч, и только некоторые аминокислоты, и который активно используется в УФ-детекторах при хроматографии?

    ЭЭЭ Нуклеиновые кислоты и на 200 поглощают. А претензий к методу на 280 не меньше чем к методу на 200. Им пользуются для чистых белков в основном. Для смесей так белок никто не измеряет. В УФ детекторах он используется потому что вы смотрите пики и все при чем в этих пиках может быть дикая смесь. После это фракции еще раз анализируют скажем форезом, Western'ом или другим более разрешающим методом. те в данном случае поглощение на 280 промежуточный ориентировочный результат.



    -Ъ- /01.11.2010 17:42/
    (katsu @ 01.11.2010 16:08)
    Ссылка на исходное сообщение  Я что-то не понимаю, а почему нет претензий к методу определения белка по спектрофотометрическому поглощения при 260-280 нм, где уж точно поглощают нуклеиновые кислоты и проч, и только некоторые аминокислоты, и который активно используется в УФ-детекторах при хроматографии?

    А наш метод (довольно давно, кстати известный) более точен и с теоретической точки зрения и как я утверждаю с практической!

    Классы прошла межет быть все, а коридор точно нет... frown.gif
    "Ваш метод" гениально прост. lol.gif



    amiel /21.01.2011 02:56/
    по Брэдфорду.
    1. Комплекс красителя с белком светочувствительный.
    2. увеличение чувствительности возможно при уменьшении объема, но здесь возникает куча нюансов.
    3. Многие белки плохо поглощают на 280 нм, микрограммы не обнаружить



    v.sheva /13.04.2011 13:03/
    Скажите влияет ли рН исследуемого раствора при определении белка по Лоури?



    ajadan /27.09.2011 14:08/
    "...А претензий к методу на 280 не меньше чем к методу на 200. Им пользуются для чистых белков в основном. Для смесей так белок никто не измеряет."

    Абсолютно не верно!

    как раз концентрацию белка в смеси не разделенных белков лучше (точнее и быстрее) измерять на 280 ( или Кристианом Варбургом 260/280), я бы даже сказал не лучше а правильнее. (исклучения - белки без триптофана, коих довольно мало, а в смесях можно сказать нет), ели вы хоть чтото знаете о своем белке, и способны найти экстинкцию для похожих - это самый простой и точный вариант, даже если вы ничего не знаете ошибиться больше чем в 2 раза практически невозможно. (для смесей белков ошибка еще меньше)
    измерения на 205 самые точные, но требуют хорошего оборудования и рук (и качественной пробоподготовки). сходу чачу им измерять конечно же нельзя. (в этой области поглощает почти все, за исключением воды, сульфатов, хуже фосыфаты, галогениды, про органику вообще молчу)
    все методы с краской МЕНЕЕ точны чем предыдущие, хотя иногда и чувствительнее. И придуманы были для измерения белков в растворах с большим количеством маскирующих (поглощающих на 280 небелковых компонентов). так ошибка в 2 раза считается очень хорошим результатом smile.gif, по бредфорду, при измерении "неизвестного" белка и калибровке по БСА, ошибка 5-10 раз частое явление. (БСА вообще не рекомендуют использовать в качестве стандарта из-за его очень высокого сродства к кумаси, впрочем это относится и к овльбумину). если у вас нет стандарта белка относящегосяк тому же семейству что и ваш исследуемый, то красками пользоваться можно только в крайнем случае если никак нельзя достоверно измерять прямым поглощением в уф.



    Guest /14.01.2013 12:47/
    Коллеги, подскажите пожалуйста, будут ли работать Брэдфорд, Лоури, BCA, если белки разведены в р-ре 6М гуанидингидрохлорида с 2М HCl? Спасибо.



    guest: ммм /14.01.2013 13:59/
    А вы проверте. скорее всего нет.



    Guest /14.01.2013 16:51/
    Если не найдутся те, кто уже проверял - возможно, попробую. Но тоже думаю, что не будут работать. Из-за соляной к-ты. Спасибо.



    Агроном /16.01.2013 14:31/
    будут ли работать Брэдфорд, Лоури, BCA


    А может и сработает Лоури - так как белок там предварительно осаждается из раствора с помощью ТХУ. Поясните - что вы подразумеваете под абброй "ВСА"? Альбумин б(в)ычий что-ли?



    guest: ммм /16.01.2013 21:00/
    --А может и сработает Лоури - так как белок там предварительно осаждается из раствора с помощью ТХУ.

    Хотел бы я видеть как ТХУК высаживает белки из 6М гуанидинийхлорида с 2М HCl
    eek.gif

    --Поясните - что вы подразумеваете под абброй "ВСА"? Альбумин б(в)ычий что-ли?
    http://molbiol.ru/protocol/17_07.html ( http://molbiol.ru/protocol/17_07.html )



    rafflesia /26.09.2014 18:59/
    Коллеги, скажите, будет ли метод Лоури правильно определять концентрацию белка, если в буфере есть аргинин? или аргинин все-таки исказит результат?



    guest: ммм /27.09.2014 06:59/
    Не должен он мешать, по идее.



    guest: ммм /27.09.2014 07:02/
    Неужели нельзя просто проверить: сравнить как реагирует Лоури на воду(буфер) и на раствор аргинина.



    metrim /19.03.2016 01:30/
    Готовил реактив для Брэдфорда больше года назад.
    Сейчас обратил внимание что на просвет в банке - какая то взвесь
    Вопрос: можно ли раствор регенерировать (докапать например фосворной кислоты, фильтрануть) или только в помойку ?
    холостое определение (1:1 реактив : вода) - бесцветный раствор без признаков синевы



    MMM /19.03.2016 06:58/
    Можете фильтрануть и сделать новую градуировку. Она может быть нехорошей. Скорее всего очень пологой, низкий коэффициент отклика. Если это так, придется все переделать. Что бы Брэдфорд долго стоял надо использовать при приготовлении краситель наилучшего качества и фосфорную кислоту тоже, DI - воду и хранить на +4оС.



    Керуак /23.04.2016 21:21/
    После ИОХ с двумя буферами (фосфатный, pH 5,3 и трис-HCl 9) мерил концентрацию по Лоури, а во фракциях минуты через две после добавления Фолина получается какая-то муть, будто капнули белой гуаши в синюю воду :< Причём в тех пробирках, которые после вымывания белков после смены буфера, так там всё нормально, мути нет. Ионообменник - ДЭАЕ целлюлоза, пропускали концентрированный медок после фильтрации через мембрану на 10 кДА. Что может давать муть?



    MMM /23.04.2016 22:10/
    Приведите исчерпывающий состав буферов, использованных для хроматографии и исходного буфера в котором был белок.



    Керуак /24.04.2016 09:06/
    Белок был без буфера, просто в дистиллировке; фосфатный - 0,2 М, KH2PO4, pH 5,3, доводил NaOH, Трис-HCl, собственно, трис (тоже 0,2 М), доводил солянкой, pH 9



    MMM /24.04.2016 09:15/
    A осадок образуется только с фосфатным буфером? попробуйте без белка пустой буфер померить. Есть предположение по поводу фосфата.



    Керуак /24.04.2016 09:39/
    Ну, в общем, как получается. Я первый раз провёл хроматографию, как только забил колонку, промывал буфером (тоже фосфатным) с pH 7. Не подумал как-то, белки не закрепились и вышли вместе со всем. После ИОХ колонка осталась в трис-буфере. Через день промыл колонку фосфатным буфером с pH 5,3, уравновесил им, провёл хроматографию, сделал Лоури. В обоих случаях мутность была во всех фракциях, где что-то выходило, т.е. в первых фракциях до смены буфера и после смены буфера, когда выходили закрепившиеся белки, а вот уже где всё отмылось, там не было мути. Я теперь грешу на трис, потому что в книжке (Справочник биохимика Доусона) написано, что трис в числе прочих соединений мешает определению белка. Но тогда почему мутность только там, где выходило, а где ничего не вышло, там её нет?
    (MMM @ 24.04.2016 10:15)
    Ссылка на исходное сообщение  A осадок образуется только с фосфатным буфером?  попробуйте без белка пустой буфер померить. Есть предположение по поводу фосфата.

    Попробую, конечно же.
    Муть мутью, но я померил на ФЭКе с ней, вроде получается что-то... Пики есть
    https://img-fotki.yandex.ru/get/45082/79581...7_45f43f86_orig ( https://img-fotki.yandex.ru/get/45082/79581649.6/0_d16c7_45f43f86_orig )



    MMM /24.04.2016 11:02/
    Возможно у вас очень высокая концентрация белка и он дает нарастворимый осадок с фосфовольфраматами. А про медно щелочной раствор в Лоури вы случайно не забыли?



    Керуак /24.04.2016 15:07/
    В смысле медно-щелочной раствор?
    По калибровке получается, что концентрация белка в вышедших после смены буфера фракциях примерно 16,69 мкг/мл



    MMM /24.04.2016 19:34/
    Перед Фолиным в методе Лоури белок выдерживается 10 минут в "щелочном" растворе медного купороса и только после этого в этот раствор добавляют Фолина.



    Керуак /24.04.2016 20:25/
    Конечно не забыл



    MMM /24.04.2016 21:37/
    а каких нибудь твинов, тритонов, нонидетов в буферах не было?



    Керуак /24.04.2016 21:56/
    Определенно нет



    Керуак /25.04.2016 15:11/
    Попробовал Лоури сделать чисто с буферами, появилась муть в пробирке с фосфатным... Думаю, нормально ли будет заменить ацетатным? pH вроде подходит



    MMM /25.04.2016 17:30/
    Ну, вот, подтверждается первое предположение о том, что фосфат взаимодействует с фосфовольфраматами и фосфомолибдатами изменяет их стехиометрию и они становятся малорастворимыми.

    ---Думаю, нормально ли будет заменить ацетатным? pH вроде подходит
    Я бы предпочел цитрат.



    Oceana777 /30.09.2016 14:21/
    Уважаемые коллеги! Помогите разобраться! Занимаюсь определением активности антиоксидантных ферментов. Их активность пересчитывается на мг белка. Белок определяю по Бредфорду. По какой формуле мне производить расчёт белка???
    Заранее спасибо



    MMM /30.09.2016 14:29/
    По градуировочному графику, который строится на основании стандартных растворов белка(чаще всего бычьего сывороточного альбумина).



    Oceana777 /30.09.2016 14:54/
    Это сделала! Получила концентрацию белка (скажем 2320) по кривой. Перевела её в мг/мл (2,232). Потом посчитала по формуле = 2.232*3 (объем буфера, в котором растирала растения) / 0,3 (масса навески, г). В итоге получила содержание белка: 22,32 мг/г сырой ткани. Правильно ли это? или нужно ещё умножать на тот объем растит.вытяжки, которую добавляла к Бредфорду?



    MMM /30.09.2016 15:36/
    Не делайте копипастов из одного форума в другой. Вы что думаете что среди мол. биологов ясновидящих больше чем среди химиков. Таки я вас уверяю их примерно одинаково нет ни там, ни здесь. Давайте потрудитесь написать, что и как делали.



    Oceana777 /30.09.2016 15:57/
    МММ - это Вы к чему? Вы написали: По градуировочному графику, который строится на основании стандартных растворов белка(чаще всего бычьего сывороточного альбумина). Я Вам ответила: Это сделала! И затем расписала ЧТО и КАК делала. Поэтому причём здесь потрудитесь написать что и как делала - не понимаю. Читайте внимательно



    MMM /30.09.2016 16:13/
    http://www.chemport.ru/forum/viewtopic.php...=915997#p915997 ( http://www.chemport.ru/forum/viewtopic.php?f=16&p=915997#p915997 )



    Oceana777 /30.09.2016 16:33/
    МММ и что? я не имею права задавать одни и те же вопросы на разных форумах?



    MMM /30.09.2016 16:53/
    Имеете! Но! В этих своих вопросах вы допускаете одни и те же недочеты никак не улучшая их. Мы бы с радостью вам помогли, но вы сами наступаете на горло собственной песне, тщательно скрывая от нас критически важную информацию, без которой любой ответ не имеет смысла.



    Oceana777 /03.10.2016 11:51/
    (MMM @ 30.09.2016 17:53)
    Ссылка на исходное сообщение  Имеете! Но! В этих своих вопросах вы допускаете одни и те же недочеты никак не улучшая их. Мы бы с радостью вам помогли, но вы сами наступаете на горло собственной песне, тщательно скрывая от нас критически важную информацию, без которой любой ответ не имеет смысла.


    МММ, конкретно от Вас я ничего не скрываю, ибо ВЫ никаких вопросов мне ВООБЩЕ не задвали, так что о чём разговор вообще???лично от Вас я ничего не скрываю, ибо именно с Вами у нас диалога не сложилось



    ksm /03.10.2016 21:03/
    (Oceana777 @ 30.09.2016 15:54)
    Ссылка на исходное сообщение  Это сделала! Получила концентрацию белка (скажем 2320) по кривой. Перевела её в мг/мл (2,232). Потом посчитала по формуле = 2.232*3 (объем буфера, в котором растирала растения) / 0,3 (масса навески, г). В итоге получила содержание белка: 22,32 мг/г сырой ткани. Правильно ли это? или нужно ещё умножать на тот объем растит.вытяжки, которую добавляла к Бредфорду?

    огласите, пожалуйста, оптическую плотность при этом (при 2320), и длину волны и что у Вас за прибор?



    Oceana777 /04.10.2016 16:18/
    (ksm @ 03.10.2016 22:03)
    Ссылка на исходное сообщение  огласите, пожалуйста, оптическую плотность при этом (при 2320), и длину волны и что у Вас за прибор?



    Оптическая плотность: примерно 1,0513
    Длина волны: 595 нм
    Прибор: СФ 2000, Россия



    ksm /05.10.2016 01:58/
    ну вы учтите, что в районе единицы по ОП градуировка уже нелинейно себя вести может. если у вас кривая до 2 ОП, то пожалуйста
    (вообще ржачно: "примерно 1.0513")



    Oceana777 /10.10.2016 15:36/
    (ksm @ 05.10.2016 02:58)
    Ссылка на исходное сообщение  ну вы учтите, что в районе единицы по ОП градуировка уже нелинейно себя вести может. если у вас кривая до 2 ОП, то пожалуйста
    (вообще ржачно: "примерно 1.0513")


    ksm, не понимаю что здесь РЖАЧНОГО? у меня большой объём экспериментального материала и я назвала Вам первую плотность, которую в тетради посмотрела. Плотность всё же меняется и в зависимости от объекта и в зависимости от воздействия,и даже в зависимости от продолжитеьности воздействия. так что ничего ржачного и нет.



    Esya /10.10.2016 16:03/
    (Oceana777 @ 10.10.2016 07:36)
    Ссылка на исходное сообщение  ksm, не понимаю что здесь РЖАЧНОГО? у меня большой объём экспериментального материала и я назвала Вам первую плотность, которую в тетради посмотрела. Плотность всё же меняется и в зависимости от объекта и в зависимости от воздействия,и даже в зависимости от продолжитеьности воздействия. так что ничего ржачного и нет.


    просто наше поколение еще на уроках физики учили округлять показания хотя бы до точности прибора... не указывать и не доволить рН до пятого знака, скажем

    потому и ржачно, что вы даже в тетрадку занесли охрененное количество незначащих цифр



    MMM /10.10.2016 16:45/
    (ksm @ 05.10.2016 02:58)
    Ссылка на исходное сообщение  ну вы учтите, что в районе единицы по ОП градуировка уже нелинейно себя вести может. если у вас кривая до 2 ОП, то пожалуйста
    (вообще ржачно: "примерно 1.0513")

    Кстати, для обычного нормально работающего брэдфорда нелинейность начинается в районе 0,5-0,7 единицы D. Но опять же, кстати, СФ 2000 умеет строить криволинейные градуировки на основе линейных многочленов. Что касается точности измерений, ну, Брэдфорд вообще не подразумевает точность выше 10%. А допускает ошибки и в 50%. Например, при градуировке по бычьему альбумину, если измерять антитела, то ошибка больше чем в 2 раза.



    ksm /11.10.2016 16:57/
    (Oceana777 @ 10.10.2016 16:36)
    Ссылка на исходное сообщение  ksm, не понимаю что здесь РЖАЧНОГО? у меня большой объём экспериментального материала и я назвала Вам первую плотность, которую в тетради посмотрела. Плотность всё же меняется и в зависимости от объекта и в зависимости от воздействия,и даже в зависимости от продолжитеьности воздействия. так что ничего ржачного и нет.

    ну не КРИЧИТЕ так на меня!!!111111111



    ksm /11.10.2016 17:31/
    Уважаемая Oceana777, как писал вам МММ вам при ваших опттических плотностях необходима криволинейная градуировка по БСА с привлечением линейных многочленов. если вы используете просто линейный коэффициент в пересчете, то, боюсь, весь ваш большой объём экспериментального материала следует переизмерить, чтобы удовлетворить требованию к линейности (т.е. 0,5-0,7 по шкале ОП). это достигается серией разбавлений. а весь ваш колоссальный труд по измерению ОП в районе единицы для большого объема экспериментального материала необходимо просто познакомить с обыкновенным педальным ведром.



    fargo /10.11.2016 15:37/
    Если в среде содержатся полифенолы, возможно ли их учесть при определении белка по Лоури? Например, если рассчитать OD для фенолов в той же пробе используя карбонат и реактив Фолина, затем определить содержания белка в этой же пробе, используя добавочно медь. В итоге, полученная разность в показаниях OD должна соответствовать белку. Или так нельзя делать. smile.gif



    MMM /10.11.2016 16:12/
    Да, делать-то мозьно, вот только если реакция на меди будет составлять доли процента реакции на Фолине без меди, то вас это не спасет. Т.е. такое возможно на хорощем приборе и при условии, что соотношение сигналов не превышает 1:1 , а лучще 5-30% от сигнала белка.



    metrim /14.01.2017 14:42/
    А продажные реактивы для Брэдфорд (Термо или Био-рад) - это та же самая рецептура, что приведена здесь? или туда добавляется что то для стабильности и повышения сроков хранения?



    MMM /14.01.2017 16:53/
    metrim! Это не вопрос для ответа. Как вообще подобные вопросы приходит в голову задавать на форуме студентов и научных сотрудников.



    metrim /14.01.2017 23:33/
    Что то не догоняю: в чем проблема вопроса или форума ....
    Имеется ввиду что "сиречь есть страшная коммерческая тайна" ?



    MMM /15.01.2017 20:25/
    Да, даже если и тайна или не тайна, откуда научные сотрудники должны знать, что происходит на каком-то заводе.








       


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler