Главная страница MolBiol.ru > Методы > Экспрессия > Taq полимераза Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Очистка Taq полимеразы (клон pTp4)

 

    Приготовление стоковой культуры

  1. со стока (-70oС) рассеять бактерии штрихом на чашку с селективной средой: {LB или 2xYT, Amp 100µg/ml, Carb 100µg/ml, Glucose 2%};
  2. отобрать несколько индивидуальных колоний, поместить их по отдельности в 5ml среды {Terrific Broth, Amp 100µg/ml, Carb 100µg/ml, Glucose 2%} в 17-50ml пробирках;
  3. 200-300rpm, 30(37)oC, ON;
  4. из каждой пробирки отобрать в стерильных условиях по 1ml, 2х промыть 1.0ml Terrific Broth (оставшуюся часть культуры поместить на +4oC);
  5. ресуспензировать в 2ml среды {Terrific Broth, Amp 100µg/ml, Carb 100µg/ml, IPTG 0.5mM};
  6. 200-300rpm, 37oC, ~3-12h;
  7. ЦФ 14krpm, 10'';
  8. сполоснуть 200µl Buf.A (ресуспензировать; ЦФ 14krpm, 10'');
  9. ресуспензировать в 40µl {Buf.A+~1mg/ml lysozym+1mM PMSF};
  10. + 40µl Buf.B, смешать;
  11. 74oC, 45';
  12. быстро охладить в ледяной бане;
  13. ЦФ 14krpm, 10', NT;
  14. отобрать супернатанты,
  15. для каждого супернатанта оценить полимеразную активность;
  16. определить, какие клоны продуцируют активную Taq полимеразу;
  17. к соответствующим оставшимся частям культуры (см. п.4) добавить DMSO до 7%, разаликвотить по 100 µl, заморозить в ж. азоте, хранить при -70oC;


  18. Приготовление стартовых аликвот культуры-продуцента Taq полимеразы

  19. разморозить аликвоту из п.17, перенести её в 300ml среды {Terrific Broth, Amp 100µg/ml, Carb 100µg/ml, Glucose 2%} в по крайней мере 1L колбе;
  20. 200-300rpm, 37oC, до OD600=0.6-0.8 (но ниже 1.0!);
  21. добавить к культуре стерильный глицерол до 10%;
  22. разаликвотить:
  23. - часть - по ~14ml культуры в 15ml пробироки,
    - остальное - по 40ml в 50ml центрифужные пробирки;

  24. охладить пробирки во льду;
  25. заморозить в жидком азоте;
  26. перенести на -70oС в какой-то чётко подписанной таре, записать, где они хранятся.


  27. Выделение Taq полимеразы

  28. разморозить 14ml аликвоту из п.21, перенести её в 1.5÷2L предварительно нагретой до 37OC среды {Terrific Broth, Amp 100µg/ml, Carb 100µg/ml, Glucose 2%} в по крайней мере 5L колбе;
  29. 200-300rpm, 37OC, до OD600 1÷1.5;
  30. * при использовании в качестве стартовой культуры pTP4 (№14) (A600=0.4) -> 2L (A600=1.1) заняло примерно 12h;

  31. ЦФ 4krpm, 10', 4OC÷NT, среду аккуратно слить;


  32. --- всё дальнейшее описание - из расчёта на 2L культуры ---

  33. (не обязательно) 1x промыть клетки 100ml Terrific Broth (ЦФ 4krpm, 10', 4OC÷NT);
  34. ресуспензировать в 2÷5L среды {Terrific Broth, Amp 100µg/ml, Carb 100µg/ml, IPTG 0.5mM};
  35. (optional)
  36. * отобрать 1ml (не индуцированный контроль);

  37. 200-300rpm, 37oC, ON;
  38. (optional)
  39. * отобрать 1ml (индуцированный контроль);

  40. сполоснуть 100ml Buf.A (ресуспензировать; ЦФ 4krpm, 10', 4oС);
  41. ресуспензировать в 40ml Buf.A(с 1mM PMSF);
  42. + 40ml Buf.B(+ ~40mg lysozym), быстро и хорошо смешать;
  43. На этом этапе суспензию бактерий можно заморозить в жидком азоте и хранить на -70OC практически неограниченное время.

    Внимание!!! Далее, во время прогрева и при подготовке к центрифугированию важно как можно меньше взбалтывать пробирку. Взбалтывание приводит к тому, что после центрифугирования в супернатанте остаётся много DNA - раствор невозможно профильтровать.

  44. 74oC, 45' (плавно перемешивая каждые 5-10');
  45. охладить в ледяной бане ~5-10';
  46. ЦФ >4krpm (лучше ~10-20krpm), 1h, 4oС;
  47. снять супернатант (должно получиться ~84ml), профильтровать через по крайней мере 0.45 µm фильтр, отобрать 45 µl - контроль после центрифугирования;
  48. разбавить осветлённый лизат Buf.C (50mM KCl, 0.5mM PMSF) в отношении ~1:1;
  49. на этом этапе лучше проконтролировать полимеразную активность:
  50. а) приготовить разведения осветлённого лизата в 1х буфере для Taq pol/BSA 0.1mg/ml:

    5 µl + 95 µl => 1:20,
    5 µl предыдущего раствора + 120 µl => 1:500,
    5 µl предыдущего раствора + 10 µl => 1:1500,
    5 µl предыдущего раствора + 11.6 µl => 1:5000;

    б) для определения активности использоватьразведения 1:500,1:1500, 1:5000; для осветлённого лизата должна получиться активность ~40u/µl;

  51. нанести осветлённый лизат на колонку Bio-Rex 70 (см. "Подготовка колонки."), предварительно уравновешенную Buf.C (50mM KCl) (~100 000u на 1ml Bio-Rex 70);


  52. --- для 60ml колонки (можно очистить до 6х106u Taq) ---

  53. промыть колонку 120ml Buf.C (50mM KCl, 0.5mM PMSF);
  54. элюировать полимеразу 120ml Buf.C (400mM KCl, 0.5mM PMSF), элюат собирать следующим образом:
    1. в отдельную пробирку первые 30ml;
    2. 30 фракций по 1ml;
    3. всё остальное - в сброс;
  55. промыть колонку 100ml Buf.C (50mM KCl), колонку можно хранить несколько месяцев при +4oC;
  56. содержимое каждой из пробирок из п.34 смешать, сбросить на центрифуге и нанести по 1µl из каждой фракций на Whatman 3MM (смотри "Определение концентрации белка на 3ММ.");
  57. объединить фракции, в которых сошёл пик белка (должно быть 11-15 фракций);
  58. провести очистку остального материала осветлённого лизата, отобрать 1/1000 материала - контроль после индукции (~15 µl для 1 литра исходной культуры);


  59. Обработка DNase & RNase

    Перед максипреп-обработкой: отобрать три 100µl аликвоты элюата и обработать их 1/3x; 1x и 3x концентрацией DNase & RNase. Провести для обработанной и необработанной полимеразы тесты на грязь и на чувствительность. Если 1/3x обработка устраняет грязь, а 3х - не снижает чувствительности, то можно ставить максипреп.

  60. к материалу из п.48 добавить:
  61. 1M MgCl2 до 10mM;
    DNase I из расчёта ~10u/ml
    RNase A из расчёта ~10µg/ml

  62. 37oC, 40';
  63. 85oC, 15' (помешивая, по крайней мере вначале);
  64. 0oC, 15' (ледяная баня);
  65. ЦФ 4.5krpm, 20', 4oС;
  66. аккуратно перенести супернатант в диализный мешок;


  67. Диализ

  68. диализовать против ~15-20 кратного объёма Buf.D в три смены:
  69. "1" -> NT (или лучше +4oС), ~6h,
    "2" -> NT (или лучше +4oС), ~6h,
    "3" -> 4oС, ON;

    -- в первых двух диализных буферах концентрация EDTA была взята в 5 раз большей: 0.5mM --
  70. извлечь Taq pol. из диализного мешка, определить активность, разаликвотить, подписать;
  71. хранить основной сток при -70oС, рабочее количество - при -20oС;
  72. для приготовления Taq pol c активностями 1u/ µl; 5u/ µl нужно использовать Dilution Buf.


  73. Подготовка колонки

  74. если готовится новая колонка:
  75. "отмучить" смолу в воде (получается ~1.8 ml на 1g сухого Bio-Rex 70):

    * взболтать смолу, дать осесть под действием силы тяжести основной фракции, мутный супернатант слить;
    * повторить 2-3 раза, пока вода после осаждения основной фракции не будет оставаться прозрачной.

    уравновесить Buf.C+50mM KCl,

    * добавить 10х Buf.C до 1х и 2M KCl до 50mM;
    * довести pH (контролировать по pH-strip) до ~7.4 добавив HCl 37% (~1ml на 30ml/60ml 50% суспензии/ Bio-Rex 70);
    * дать смоле осесть, супернатант снять, ресуспензировать смолу в Buf.С/50mM KCl.

  76. если колонка готовая:
  77. промыть колонку 150ml Buf.C+50mM KCl, проконтролировать pH;


    Оценка связывания Taq полимеразы с Bio-Rex 70

  78. приготовить 1ml колонку Bio-Rex 70;


  79. -- далее, при нанесении, промывке и элюции - собирать элюат фракциями по 250µl --

  80. нанести на колонку 10-15ml осветлённого лизата;
  81. промыть колонку 1.5ml С (50mM KCl);
  82. элюировать белок 1.5ml С (400mM KCl);
  83. определить на 3MM фракции, в которых сошёл белок, объединить их;
  84. нанести по 2µl из фракций "нанесения на колонку" на 10% SDS-PAAG, определить, какое количество осветлённого лизата насыщает колонку;
  85. определить активность осветлённого лизата и полученного с колонки белка, расчитать нормальное и насыщающее количество.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 13217



Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


    Растворы

    Terrific Broth, Amp(100 µg/ml), Carb(100µg/ml), Glucose 2%

    (готовить перед использованием):

    Конц.Сток1L
    Terrific Broth~1х950ml
    Glucose2%40%50ml
    Amp100µg/ml50mg/ml2ml
    Carbenicillin100µg/ml100mg/ml1ml

    Buf.A

    (хранить при +4oС), готовить как 10х:

    10хСток50ml250ml
    Tris Cl, pH7.950mM0.5M1M25ml125ml
    Glucose50mM0.5M2M12.5ml62.5ml
    EDTA1mM10mM0.5M1.0ml5.0ml
    H2O  mQ11.5ml57.5ml

    Buf.B

    (хранить при +4oС)

    Конц.Сток100ml250ml
    Tris Cl, pH7.410mM1M1ml2.5ml
    KCl50mM2M2.5ml6.25ml
    EDTA1mM0.5M0.2ml0.5ml
    Tween 200.5%
    (v/v)
    100%0.5ml
    0.556g
    1.25ml
    1.39g

    Triton X100
    (или Nonident P-40)
    0.5%
    (v/v)
    100%0.5ml
    0.532g
    1.25ml
    1.33g

    H2O mQ95.32ml238.3ml

    Buf.C

    (хранить при +4oС), готовить как 10х:

    1x10xСток500ml
    Hepes, pH7.420mM0.2M1M100ml
    EDTA1mM10mM0.5M10ml
    Tween 200.5% (v/v)5% (v/v)100%25ml
    Triton X1000.5% (v/v)5% (v/v)100%25ml
    H2O  mQ340ml

    Buf.C(50mM KCl)

    (хранить при +4oС):

    Конц.Сток300ml800ml
    Buf.C1x10x30ml80ml
    KCl50mM2M7.5ml20ml
    PMSF* в изопропаноле0.5mM100mM1.5ml4ml
    H2O mQ261ml696ml

    * добавлять непосредственно перед использованием из расчёта 0.5ml на 100ml.

    Buf.C(400mM KCl)

    (хранить при +4oС):

    Конц.Сток300ml800ml
    Buf.C1x10x30ml80ml
    KCl400mM2M60ml160ml
    PMSF* в изопропаноле0.5mM100mM1.5ml4ml
    H2O mQ208.5ml556ml

    * добавлять непосредственно перед использованием из расчёта 0.5ml на 100ml.

    Buf.D

    для диализа (хранить при +4oС)

    Конц.Сток500ml800ml
    Hepes, pH7.4, p=1.06420mM1M10ml
    10.64g
    16ml
    17.02g

    KCl100mM2M25ml40ml
    EDTA0.1mM0.5M100µl160µl
    Glycerol50%87%
    p=1.23
    287ml
    353g
    459ml
    565g

    PMSF*в изопропаноле0.5mM100mM2.5ml4.0ml
    DTT*1mM1M0.5ml0.8ml
    H2O mQ175ml280ml

    * добавлять непосредственно перед использованием.

    PMSF 0.1M

    (хранить при -20oС)

    Конц.Сток20ml
    C7H7FO2S100mM174.2g/M0.348g
    Isopropanol  20ml

    Dilution Buf.

    для разведенияTaq pol(хранить при +4--20oС)

    Конц.Сток50ml
    Hepes, pH7.420mM1M1ml
    KCl100mM2M2.5ml
    EDTA0.1mM0.5M10 µl
    Glycerol50%87%
    p=1.23
    28.7ml
    35.3g

    Gelatin0.005%2%125µl
    DTT*1mM1M50 µl
    H2O mQ17.62ml

    * добавлять непосредственно перед использованием.
    Использовать 10ml рабочими порциями, к которым добавлять по 10µl DTT 1M.



    Комментарии

    Общие

  • pTP4 конструкция была приготовлена точно так же, как описано в статье Engelke et al. 1990 Analytical Biochemistry, Dec 191(2) p.369-400.
  • Приведённая методика - изменённый вариант метода, описанного в оригинальной статье (опущена преципитация PEI), добавлена обработка DNase I & RNase A.
  • Carbenicillin - дорогой антибиотик. Но при его использовании бактерии лучше сохраняют плазмиду, выход Taq полимеразы становится значительно устойчивее. В принципе, можно обойтись и без карбенициллина: в этом случае лучше не использовать "стартовые аликвоты", а выращивать максипреп-культуру сразу из отобранных колоний.
  • Taq полимераза - фермент термостабильный, это даёт возможность практически всю очистку проводить при NT.
  • Нормальный выход: ~1.0-1.6млн. единиц на 1 литр индуцированной культуры.
  • Методика определения активности: смотри протокол "Определение активности полимеразы.".
  • Если есть желание/необходимость проследить за ходом очистки на форезе используются контроли из пунктов 30, 32, 39, 48. В каждом случае отбирается ~0.1% материала. То есть, если отобранный материал развести (для 30 и 32 - после переосаждения) в одинаковом объёме буфера для нанесения на SDS-PAAG, то будет весьма удобно оценивать потери в ходе очистки.
  • Штамм №14: мы не знаем, какой именно штамм E.coli мы используем: он получен из Берлина. Супернатант получается "плохо фильтрующимся" (можно профильтровать лишь в том случае, если пробирка не взбалтывалась). Штаммы BL21 и INVaF' образуют после прогрева осадок, хорошо отделяющийся от супернатанта. Они хорошо фильтруются вне зависимости от того, болтали пробирку или нет. Но Берлинские штаммы дают заметно больше фермента.
  • По пунктам

    п.1-24.

  • Клон-продуцент нестабилен, поэтому необходим этап отбора "хорошего" клона. Способ частичной очистки Taq полимеразы на этапе селекции - уменьшенная копия максипреп-очистки.
  • При приготовлении стоковой культуры имеет смысл определять активность в два этапа:
    1. по 0.5 µl из супернатантов п.14 (оценить, какие из культур вообще продуцируют Taq pol.);
    2. для оценки, какая из культур лучше: приготовить для каждого позитивного клона 3-4 десятикратных разведения (см. "Определение активности полимеразы.") и измерить активности для этих разведений;

    Внимание!!! Ни в коем случае нельзя судить об активности по одному измерению, т.к. слишком большое количество фермента ингибирует реакцию.

    п.1.

  • 2% глюкоза выступает здесь как репрессор lac промотора (под контролем которого находится ген Taq полимеразы). Катаболитная репрессия - хоть и очень простой метод, но вполне действенный: например, на чашках с 2% глюкозой сине-белый тест не работает.
  • п.3.

  • Инкубация при 30oС - чтобы культура не "перерастала".
  • п.4.

  • Промывка Terrific Broth, чтобы перед индукцией избавиться от глюкозы. 2х промывка проводится следующим образом:
  • * поместить 1ml культуры в стерильную 1.5ml ЦФ-пробирку;
    * ЦФ либо 2' при 6krpm (в микроцентрифуге с регулируемой скоростью вращения), либо 10'' при 14krpm;
    * убрать супернатант, бактерии ресуспензировать на вортексе в 1.0ml Terrific Broth;
    * повторить: п.2-3.

    п.11.

  • Большинство белков E.coli после 74oC, 45' денатурирует, а Taq полимераза - нет.
  • п.28.

  • Отмывку проводить в металлических ЦФ стаканах. Перед этим стаканы и пластиковые крышки тщательно вымыть, протереть спиртом и высушить под UV (стерилизация). Ресуспензирование и т.п. проводить на столе (не под ламинаром), нужно стараться делать это чисто.
  • п.36.

  • Если бактериальная суспензия была заморожена, то отсчёт времени начинается после того, как она растает.
  • К концу прогрева лизат должен разделиться на прозрачную жидкость и кашеобразную суспензию, при этом существенно падает вязкость раствора.
  • Обратить внимание на то, чтобы уровень жидкости в пробирке был не выше уровня жидкости в водяном термостате (иначе будет плохой теплообмен).
  • п.40.

  • После разведения Taq полимеразу можно без потери активности заморозить в жидком азоте и хранить на -70OC или держать приблизительно неделю во льду.
  • п.42.

  • Bio-Rex 70 /Bio-Rad/ - ионообменная смола с функциональной группой: R-COO-. На ней не должны задерживаться нуклеиновые кислоты (если, конечно, раствор перед нанесением на колонку был профильтрован).
  • 100 000u на 1ml BioRex 70: имеются в виду единицы, определённые в реакции удлиннения праймера (активность, определённая сравнением с "фирменной" полимеразой может оказаться в 3-6 раз меньше). Если нанести на колонку избыток полимеразы, то с 1ml BioRex 70 можно снять приблизительно 130 000u.
  • п.44.

  • На самом деле, Taq полимераза сходит с колонке и при элюции буфером С (200mM KCl); но при этом она сползает в объёме буфера приблизительно в два раза большем, чем при использовании 400mM KCl. Перед элюцией колонку можно дополнительно промыть буфером С (100mM KCl), но некоторая (заметная на 3MM) часть Taq полимеразы при этом с колонки сваливается.
  • Мёртвый объём можно определить при нанесении материала на колонку. Осветлённый лизат имеет желтоватый цвет. Мёртвый объём - объём, бесцветного буфера, сошедшего с колонке при нанесении осветлённого лизата.
  • п.48.

  • Без потери активности можно заморозить в жидком азоте и хранить на -70OC или держать приблизительно неделю во льду.
  • п.49.

  • Тест на грязь: восемь реакций по 10-15µl с двукратными разведениями полимеразы (в первой пробирке - 1µl Taq) с M13 forward universal primer: 5' gAC gTT gTA AAA CgA Cgg CCA gT и M13 reverse universal primer: 5' ATA ACA ATT TCA CAC Agg AAA CAg CTA TgA. Обычно грязь - полоска в районе 1.8kbp's.
    Шаг:Т (oC):Время:
    1940:10
    2550:15
    3681:00
    4go to 134 add. times
    540
    6END 
  • Тест на чувствительность: восемь реакций по 10-15µl с последовательным 2-кратным разведением матрицы . Матрица - разведённый ПЦР-продукт. Финальное разведение в первой пробирке соответствует двадцати циклам ПЦР: 1/106. 25 циклов ПЦР с параметрами - как указано выше. Taq полимераза: из расчёта 12.5u на 100µl ПЦР-смеси.
  • Единицы активности DNase I определяли сравнительной раститровкой относительно DNase ONE /Promega/.
  • п.52.

  • Диализ проводился в укреплённом на качающейся платформе 0.5L цилиндре (500ml буфера D; горловина затянута парафильмом и Saran Wrap; диализный мешок свободно плавает).
  • Во время диализа объём препарата значительно уменьшается (приблизительно в два - три раза, в зависимости от типа диализной мембраны).

    Дополнения, комментарии, вопросы





       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler