Главная страница MolBiol.ru > Методы > Экспрессия > Pfu полимераза Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Очистка Pfu полимеразы

 

    Комментарии

    Общие

  • Экспрессирующая конструкция описана в "Protein expression and purification, 11, 179-84 (1997) Expression in Escherichia coli of the Thermostable DNA Polymerase from Pyrococcus furisous. C. Lu and H.P. Erickson".
  • Индукция и очистка проводятся точно так же, как при очистке Taq pol "Очистка Taq полимеразы (клон pTp4).". Отличия:
    1. вместо Amp используется смесь Carbenicillin 200 µg/ml + Chloramphenicol 34 µg/ml;
    2. возможное время индукции 4h-ON;
    3. приятным отличием в случае Pfu pol. является то, что преципитат при тепловой обработке п.36 получается кашеобразным: бактериальная DNA в супернатант не переходит как бы вы не обращались с раствором в пп.34-36;
    4. на 30ml колонку можно наносить осветлённый лизат, содержащий ~15ku (0.5ku на 1ml колонки);
  • В наших руках получался выход ~30,000u на литр культуры (но, возможно, что различие со статьёй в 2.7 раз связано с использованием Taq-полимеразного буфера для оценки активности "Определение активности полимеразы.").


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 10018

    Растворы

    2xYT, Cb/Cam, Glucose 2%

    (готовить перед использованием):

    Конц.Сток1L
    2xYT~1х950ml
    Glucose2%40%50ml
    Carbenicillin200 µg/ml100mg/ml2ml
    Chloramphenicol34 µg/ml34mg/ml1ml

    Дополнения, комментарии, вопросы

    Star /15.06.2005 19:40/
    Коллеги, а где можно достать штаммы и экспрессирующиеся конструкции Taq и Pfu-полимераз. mail to: startsev@pochta.ru



    Atropos /19.10.2006 15:43/
    Подскажите, а можно ли в принципе очищать на анионном носителе?

    P. S. В смысле на анионообменном, в методике для Taq и в большинстве статей основной является очиска на катионообименном.



    AVP /19.10.2006 21:48/
    (Atropos @ 19.10.2006 08:43)
    Ссылка на исходное сообщение  Подскажите, а можно ли в принципе очищать на анионном носителе?


    shuffle.gif
    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.f...l=pubmed_docsum ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Retrieve&dopt=AbstractPlus&list_uids=9367814&query_hl=1&itool=pubmed_docsum )
    Protein Expr Purif. 1997 Nov;11(2):179-84.
    Expression in Escherichia coli of the thermostable DNA polymerase from Pyrococcus furiosus.
    Lu C, Erickson HP.
    Department of Cell Biology, Duke University Medical Center, Durham, North Carolina 27710, USA.

    Pfu, the DNA polymerase from Pyrococcus furiosus, has the lowest error rate of any known polymerase in polymerase chain reaction (PCR) amplification. Previously the protein has been purified from P. furiosus bacterial cultures, and a recombinant form has been produced in a baculovirus system. We have produced a pET plasmid for expression of Pfu in Escherichia coli (the expression plasmid pETpfu is available from ATCC, Accession No. 87496) and found that this plasmid is toxic or unstable in the expressing strain BL21(DE3), even in the absence of induction. However, the plasmid was stable in BL21(DE3) containing the pLysS plasmid, which suppresses expression prior to induction, and a 90-kDa protein was expressed upon addition of isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside. The protein was purified by heating (to denature E. coli proteins), followed by chromatography on P11 phosphocellulose and mono Q columns. The purified protein had the same activity as the commercially obtained baculovirus-expressed Pfu in both DNA polymerase and PCR reactions. This bacterial expression system appears to be the method of choice for production of Pfu.

    etc.

    Good luck



    lepikhov /30.04.2008 10:40/
    Я очищаю на гепарин-сефарозе. Весьма недурно получается. Если есть конкретные вопросы - спрашивайте.



    Guest /02.05.2008 17:43/
    Почти все ферменты нуклеинового обмена неплохо чистятся на анионниках. p11 отлично идет для многих ферментов.








       


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler