Главная страница MolBiol.ru > Методы > Иммуногисто.. > Локализация РНК на срезах Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Гибридизация in situ на срезах дрозофилы

Елена Набирочкина
Институт Биологии Гена РАН

    Приготовление препаратов

  1. приготовить 5-7µm срезы (см. "Фиксация и заливка в парафин (дрозофила)."), перенести кисточкой на предметное стекло в каплю воды;
  2. сушить в термостате 37oС, ON.


  3. Депарафинирование

  4. депарафинировать в гистологических стаканах:
  5. ксилол (I) 5'
    ксилол (II) => 5'
    ксилол:EtOH 100% (1:1) => 2'
    EtOH (100%) (I) => 1'
    EtOH (100%) (II) => 1'
    EtOH (96%) => 1'
    EtOH (70%) (I) => 1'
    EtOH (70%) (II) => 1'
    H2O (mQ) => 1';

  6. накапливать в стеклоприёмнике mQ, >2'.


  7. Предгибридизация

    все отмывки проводятся в 100 ml стеклоприемниках.

  8. инкубировать 2х 5' в TBS, NT;
  9. 15' {TBS + 0.3% Tween-20}, NT;
  10. 5' TBS, NT;
  11. + 100-200µl TE/Proteinase K на препарат, стекло на 37oС; 5';
  12. сбросить раствор, обмакнув о фильтровалку;
  13. + 100-200µl {TBS + 4% PFA} на препарат, 10';
  14. сбросить раствор;
  15. отмыть 2х 5' в TBS/глицин, NT;
  16. 2х 5' на качалке в TEA/AA;
  17. + 100-200µl предгибридизационного буфера на препарат;
  18. инкубация в заранее прогретой влажной камере 37oС, >10'.


  19. Гибридизация

  20. сбросить предгибридизационный буфер;
  21. добавить гибридизационную смесь: 30µl гибрид. буфера с 5-10ng DIG-меченной RNA;
  22. накрыть силиконизированным стеклом (без пузырей);
  23. инкубировать при 42oС во влажной камере (фильтровалка, смоченная 4хSSC) ON.


  24. Отмывка

    в 50 ml стаканах.

  25. осторожно снять покровное стекло под 2хSSC;
  26. 2хSSC NT, 5-10' (не ставить разные гибридизации в один контейнер);
  27. 2x SSC на качалке 37oC, 2х 15';
  28. 1x SSC на качалке 37oC, 2x 15';
  29. + 100-200µl NTE / RNaseA (20µg/ml) на стекло, инкубировать во влажной камере, 37oС, 30';
  30. отмыть в качающейся бане в 0.1хSSC, 37oС, 2х 30'.
  31. стараться работать аккуратно, чтобы не испачкать камеру RNase;
    отметить стакан, используемый только для отмывки от RNase.


    Иммунодетекция

  32. инкубировать на качалке 2х 10' в В1 (в стеклоприемнике или 50 ml стакане);
  33. + 100-200µl блокирующего раствора на стекло, инкубировать во влажной камере 30' NT;
  34. сбросить раствор, обмакнуть о фильтровалку;
  35. + 100-200µl {B.1 + 0.1% Tween-20 + развед. анти -DIG alkaline phosphate (1:100; 1:500; 1:1000)} на стекло;
  36. NT, 2h во влажной камере;
  37. отмыть на качалке 2х 10' в B.1;
  38. инкубировать 10' в В.2, NT;
  39. приготовить красящий раствор B.2/ NBT/ X-phos./levamisol;
  40. + ~200µl красящего раствора на препарат и инкубировать во влажной камере 2-24h;
  41. оптимальное время инкубации определяется сравнением окрашивания препаратов с sense и antisense зондами.

  42. остановить реакцию в B.3;
  43. отмыть в dH2O.


  44. Заключение в Tris-glycerol mountant

  45. ~10-15µl tris-glycerol mountant на препарат;
  46. накрыть покровным стеклом, желательно без пузырей;
  47. осторожно, стараясь не сдвинуть стекло, убрать фильтровалкой лишнюю жидкость;
  48. подсушить 5-10’ NT;
  49. аккуратно обвести периметр покровного стекла бесцветным лаком для ногтей;
  50. препараты хранить при NT в темноте.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 12134



Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


    Растворы

    TBS

    10x (хранить при 4oС):

    Конц.Сток100ml
    Tris Cl pH7.50.1M1M10ml
    NaCl1.5M5M30ml
    H2O mQ60ml

    PFA

    ПФА (параформальдегид) 37% (свежеприготовленный для иммуногистохимии).

    1. в пробирке с завинчивающейся крышкой смешать:

    ПФА (тв.) => 0.37g,
    H2O => 1.0ml
    NaOH (1N) => 14µl;

    2. растворить в кипящей водяной бане (растворять до тех пор, пока pH не опуститься до ~7.0 => ~1-3').

    Раствор I

    (хранится несколько дней при 4oС):
    TBS + 0.1% NP-40.

    NTE

    (хранить при 4oС):

    Конц.Сток100ml
    NaCl500mM5.0M10.0ml
    Tris Cl pH8.010mM1.0M1.0ml
    EDTA1mM0.5M0.2ml
    H2O mQ88.8ml

    TEA

    1M (хранить при 4oС):

    Конц.Сток50ml
    Triethanolamine1M149.19g/M7.46g
    6.66ml

    Tris Cl (pH 8.0)0.1M1.0M1.0ml
    H2O mQ43.34ml

    TE/Proteinase K

    (свежеприготовленный) (TE – хранить при +4oC)

    Конц.Сток1ml
    EDTA0.05M0.5M0.1ml
    Tris Cl (pH 8.0)0.1M1.0M0.1ml
    RNase-free Priteinase K10µg/ml10µg/ml1µl
    H2O mQ0.8ml

    TBS/ 0.1M глицин   


    100ml TBS + 0.75g глицина (свежеприготовленный)

    TEA/AA (0.25% v/v)   


    100ml TEA + 0.25ml acetic anhydride (уксусный ангидрид) (свежеприготовленный)

    Предгибридизационный буфер

    (хранить при -20oС):

    Конц.Сток2ml
    SSC20х400µl
    формамид деиониз.50% (v/v)100%1.0ml
    H2O mQ600µl

    Гибридизационный буфер

    (хранить при -20oС):

    Конц.Сток2.00ml
    формамид деиониз.40%100%800µl
    декстрансульфат10%50%400µl
    раствор Денхардта1x50х40µl
    SSC4x20х400µl
    DTT10mM1M20µl
    yeast tRNA0.85µg/µl10µg/µl200µl
    Salm. sperm DNA0.85µg/µl10µg/µl200µl

    B1

    (хранить при 4oС):

    Конц.Сток100ml
    Tris Cl pH7.50.1M1M10.0ml
    NaCl150mM5M3.0ml
    H2O mQ87.0ml

    B2

    (хранить при 4oС):

    Конц.Сток100ml
    Tris Cl pH 9.5100mM1M10.0ml
    NaCl100mM5M2.0ml
    MgCl250mM1M5.0ml
    H2O mQ83.0ml

    B3

    (хранить при 4oС) = TE, pH 8.1.

    Блокирующий раствор

    (свежеприготовленный):

    Конц.Сток100ml
    B10.97x1x97ml
    Triton X-1000.1%10%1ml
    Сыворотка2%100%2ml

    NBT раствор

    (хранить при -20oС):

    Конц.Сток1ml
    NBT75mg/mlтв.75mg
    DMFA*70%100%700µl
    H2O mQ300µl

    X-phosphate раствор

    (хранить при -20oС):

    Сток1ml
    X-phosphate50mg/ml50mg
    DMFA*100%1.0ml

    * - dimetilformamid

    B.2/ NBT/ X-phos./ levamisol

    (свежеприготовленный):

    Конц.Сток2ml
    B.2~100%100%2ml
    NBT0.338mg/ml75mg/ml9µl
    X-phosphate0.175mg/ml50mg/ml7µl
    levamisole1mM (0.24mg/ml)2µl

    левамизол - используется для "забивки" эндогенных фосфатаз.cтоковый раствор (1М) хранится в течение нескольких недель при 4oС.

    Tris-glycerol mountant

    (хранить при NT):

    Конц.Сток10.0ml
    glycerol90%100%9.0ml
    Tris Cl (pH 8.0)0.1M1.0M1.0ml

    Дополнения, комментарии, вопросы

    adam /28.07.2005 10:45/
    Зачем нужна прегибридизация????? Подскажите



    LMP /28.07.2005 20:49/
    иногда рассматривается как "забивка"



    Гость /01.02.2007 20:25/
    In situ hybridization protocol for Drosophila embryos.

    For digoxygenin labeled RNA probes
    Incorporating maleic acid blocking buffer


    A. Collection, preparation and fixation of embryos

    1) Collect and rinse embryos in H2O or Drosowash (0.7%NaCl, 0.03% Triton X100)

    2) Dechorionate for 3 min in 50% Clorox. Wash thoroughly. (I wash for 1- 1.5 min under running distillate water, then dry on paper towel).


    3) Fix embryos for 50 min in

    1.35 ml 37% formaldehyde
    0.5 ml 10X PBS
    0.5 ml 0.5 M EGTA
    2.65 ml H2O
    5 ml heptane
    Make this solution fresh every time. Rotate or shake embryos constantly.

    4) Devitellinize the embryos by removing the aqueous phase (bottom) and adding about 15 ml of methanol. Shake vigorously for 30 sec to several min. Devitellinized embryos will sink.
    - Rinse embryos with 5 ml of methanol, then 2 times with 5 ml of ethanol.
    Store at –20oC. Longer storage time may decrease background. I have used embryos that were stored for 1 year without noticeable loss of signal.


    B. Pre treatment of embryos.
    Make 100 ml HMHyb (look at buffer page). Aliquot into 15 ml. Store at –20oC
    Make 1ml 100 mg/ml glycine (100 mg glycine and 1 ml H2O)

    Make fresh solutions. For 5 samples:

    1X PBT 1:1 HMHyb/PBT
    10 ml 10X PBS 5 ml HMHyb
    500 ml 20% tween 20 5 ml PBT
    90 ml H2O
    filter sterilize

    10ml/ml proteinase K in PBT PBT + 2 mg/ml glycine
    5ml ~15 mg/ml proteinase K, “Roche” (at 4oC) 200ml 100mg/ml glycine
    5 ml PBT 10 ml PBT

    50 % xylene / 50 % ethanol
    5 ml xylene
    5 ml ethanol

    90% xylene/ 10% ethanol
    9 ml xylene
    1 ml ethanol

    PBT-5% formaldehyde
    20 ml 1X PBT
    2.631 ml 37% formaldehyde

    3:1 MeOH/ PBT-5% formaldehyde
    6 ml MeOH
    2 ml PBT-5% formaldehyde

    2:2 MeOH/ PBT-5% formaldehyde
    4 ml MeOH
    4 ml PBT-5% formaldehyde

    1:3 MeOH/ PBT-5% formaldehyde
    2 ml MeOH
    6 ml PBT-5% formaldehyde

    1) warm up embryos to room temperature.

    2) Rinse in 50% EtOH/50% xylene, then soak in 90% xylene/10% ethanol for several hours (at least 1 hour). Rinse again in 50% EtOH/50% xylene then several times in ethanol. This step is supposed to reduce background.

    3) Rinse twice in MeOH, and then 2 min in 3:1 MeOH/ PBT-5% formaldehyde; 2 min in 2:2 MeOH/ PBT-5% formaldehyde; 2 min in1:3 MeOH/ PBT-5% formaldehyde. Post-fix for 30 min in PBT-5% formaldehyde. (The series is supposed to help with early embryos).

    4) Rinse 3 times in PBT (2 min each).

    5) Incubate 3 min with 10mg/ml proteinase K in PBT. Thins step is essential and lowers background but too long of incubation will cause the embryos to break up in hybridizations.

    6) Stop by quick rinsing in PBT + 2 mg/ml glycine, and then washing embryos 1 time for 5 min with PBT + 2 mg/ml glycine.

    7) Rinse 1 time with PBT, then wash for 2 min with PBT.

    8) Post-fix 30 min in PBT + 5% formaldehyde.

    9) Rinse 1 time with PBT, then wash 4 times for 2 min with PBT.

    C. Pre Hybridization, hybridization, and washing.

    1) Rinse in 50% HMHyb/50% PBT, then in HMHyb buffer. Place embryos at 55oC for 3 hours. (Check the temperature at thermostat).

    2) Replace HMHyb with fresh HMHyb. Pre hybridize at 55oC for at least 1 hour. Embryos can stored in HMHyb for at least 2 weeks at -20 oC.

    3) Replace HMHyb with 200ml HMHyb + 2ml probe in HMHyb. Hybridize overnight at 55oC. Mix a few times over an hour before going home and a few times when you return the next day.

    (The optimum temperature varies depending on the probe. For the SxlPe probe 50oC seems to be optimum. If you use a lower temperature, do the subsequent washes at the alternative temperature. If you have a long GC rich probe you might want to raise the hyb temp to 65oC. This will not damage the embryos.)


    Make 300 ml 1X MAB +0.1% tween 20 buffer, filter sterilize into several tubes.

    300 ml 1X MAB +0.1% tween 20 buffer
    (100 mM maleic acid, 150 mM NaCl, pH=7.5)

    2.629g NaCl
    3.483g maleic acid (Sigma)
    300 ml H2O
    pH=7.5

    Mix NaCl and maleic acid in 250 ml H2O and start adding solid NaOH until solution begin to clear at pH~6. Then finish titration to pH= 7.5 with liquid NaOH.
    (this takes enormous amount of base to pH).

    Add volume to 300 ml.
    Add 1.5 ml 20% tween 20

    Filter sterilize into several tubes.









    Unfreeze 10% BMB (Boehringer Mannheim Blocking Reagent) at 37oC and aliquot it into several tubes, ~ 5 ml in each.

    MAB +2% BMB
    10 ml 1X MAB
    2 ml BMB

    4) Wash embryos 4 times for 30 min with warm (50oC) HMHyb, then 4 times with 1X MAB (maleic acid buffer + 0.1% Tween 20 = 100 mM maleic acid, 150 mM NaCl, pH=7.5).

    Detection.

    1) Block for 2 hours with MAB + 2% Boehringer Mannheim Blocking Reagent

    2) Block for 1.5 hours with MAB + 2% Boehringer Mannheim Blocking Reagent

    3) Add pre-adsorbed alkaline phosphatase couples anti-digoxygenin antibody to a final dilution of 1:2000. Typically I add 5ml of 1:10 Ab to 1.0 ml MAB +2%BMB. Rotate overnight at 4oC.

    1.5 ml of Ab
    2.5 ml MAB +2%BMB
    rotate for 30 min at room temperature
    add 0.5 ml to each tube with embryos.








       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler