Главная страница MolBiol.ru > Методы > Макро-методы > 384-луночный PCR Rambler's Top100  English version
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

PCR на 384-луночных плашках

 

    Заранее

  1. подобрать температуру отжига праймеров;
  2. убедиться, что имеется достаточно PCR плашек, заклеивающей плёнки и Q-крышек;
  3. приготовить: PCR-buffer, 5M Betaine - с избытком, dNTP’s, праймеры, Taq/Pfu mix (100:1 по единицам активности) - можно не слишком большой избыток;


  4. Проведение PCR

  5. разморозить бактериальные плашки (выложив в один слой);
  6. подписать 384-PCR плашки;
  7. приготовить PCR-mix, внести его в плашки многокональной пипеткой или автоматическим Multidrop 384 диспенсером;
  8. закрытые крышками или заклеенные плашки ЦФ ~800rpm, 3', NT (не обязательно);
  9. двукратный перенос репликатором;
  10. заклеить плашки;
  11. провести PCR;


  12. После PCR

  13. вынимать плашки из машины поочерёдно приподнимая изогнутым пинцетом (или отвёрткой) каждый из четырёх углов, придерживать плашку и избегать рывков, иначе PCR-mix окажется на крышке;
  14. (не обязательно) ЦФ ~800rpm, 3', NT;
  15. провести контрольный форез, отобрав по 0.5-1µl из 8-16 ячеек;
  16. кратковременное (пара дней) хранение: +4oC, длительное: -20-70oC (предварительно охлаждённые на +4oC). Записать в журнал локализацию PCR-библиотеки;
  17. после оттаивания: ЦФ ~800rpm, 3', NT;


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 8249

    Растворы

    PCR buffer 10x

    (хранить при +4oC):

    Конц.Сток500ml
    Tris Cl, pH 8.6*0.5M1M250ml
    KCl0.5M2M125ml
    MgCl215mM1M7.5ml
    Tween 201%100%
    p=1.108
    5.0ml
    5.54g

    H2O mQ112.5ml
    Конц.Сток500ml
    Tris Cl, pH 8.6*0.5M1M250ml
    KCl0.5M2M125ml
    MgCl215mM1M7.5ml
    Tween 201%10%50ml
    H2O mQ67.5ml

    p (10x Buf.) = 1.018 g/ml
    * - другой способ: 175ml (1M Trise-base) + 75ml(1M Trise-HCl).


    PCR буфер 2.5х

    (хранить при +4oС)

    Конц.Сток100ml300ml
    Buffer (15mM MgCl2)2.5x10x25ml75ml
    Betaine3.75M5M74.75ml224.25ml
    Cresol red (Na)125 µM50mM250 µl0.75ml

    p (2.5x buffer) = 1.06g/ml


    PCR mix

    (хранить – кратковременное хранение +4oС; долговременное –20oС).

    Конц.Сток72.5ml*
    PCR буфер1x2.5x29ml
    dNTP’s0.2mM25mM580 µl
    Primer#1 & #2200pmol/ml?? µl 
    H2O mQ?ml 
    Taq/Pfu pol**50-250u/ml?u/ µl?µl 

    * - 72.5ml достаточно для 9 плашек (20 µl в ячейке; 110ml для 30µl);
    ** - Taq(u):Pfu(u)=100:1.




Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/



    Комментарии

    Общие

  • Общее правило работы: в библиотечную бактериальную плашку можно погружать только стерильный репликатор. Поэтому, при создании одной PCR-копии библиотеки репликаторов тратится в два раза больше, чем PCR-плашек.
  • Иногда плашки оказываются бракованными - некоторые ячейки у них подтекают. Обычно проблема распространяется на всю коробку, так что для особо ответственных реакций лучше провести первую серию взяв по одной плашке из коробки, а затем работать только на хороших.
  • Умеренные количества конденсата можно промакнуть фильтровалкой (для бактерий - стерильным куском Watman 3MM).


  • По пунктам

    п. 1.

  • Её приходится подбирать экспериментально; хорошим первым приближением является температура плавления, которую даёт программа "Oligo" (онлайн анализ свойств праймеров можно провести с помощью программы Oligo Analyzer 2.5 компании Integrated DNA Technologies).
  • Температуру отжига нужно подбирать в том же буфере, в котором будет проводиться реакция. Добавление бетаина заметно её снижает (добавление сахарозы - не изменяет). В случае M13 универсальной праймер-пары (M13-23 / M13-30) Tamax снизилась с 71oС до 67oС при добавлении бетаина до 1.5M.
  • п. 3.

  • Удобно приготовить:
  • * смесь всех 4 dNTP’s 100mM или 25mM;
    * смесь праймеров.

    п. 4.

  • Все фокусы с "однослойным" раскладыванием плашек посвящены тому, чтобы с внутренней стороны крышки не образовывался конденсат, который способен стать жидким мостиком между ячейками плашки. Правило очень простое: конденсат образуется тогда, когда температура крышки становится меньше температуры плашки.
  • п. 4.

  • Если плашек много - лучше на штрихкод-машине. Если вручную - подписывать корпус плашки с двух сторон: узкая сторона - где срезаны углы "столбец 24"; широкая - соответствующая "ряду P".
  • п. 6.

  • Фермент вносится в общую смесь самым последним (мы опасаемся, что Pfu полимераза может повредить праймеры, если PCR-mix будет слишком долго болтаться при комнатной температуре). Таким образом, перед внесением фермента на столе должны лежать: подписанные 384-ABT плашки, ванночка для многоканальной пипетки, бактериальные плашки и извлечённые из пакета репликаторы.
  • Однако, слишком торопиться или паниковать по поводу Pfu экзонуклеазы тоже не надо: по нашему опыту, PCR-смесь с добавленными ферментами может стоять ~15h при 4oC без какого либо уменьшения эффективности PCR-реакции.
  • При раскапывании PCR-mix по плашкам остаётся некоторый избыток смеси. Его нужно собирать в 50ml пробирку и хранить при -20oС. Этот запас расходуется при раскапывании последней серии плашек (соответственно, для этой серии готовится меньшее количество общей смеси).
  • п. 7.

  • Чтобы убрать пузырьки воздуха со дна ячеек. Этот пункт необязателен, если PCR-смесь аккуратно вносится мультиканальной пипеткой.
  • п. 8.

  • При переносе надо ориентироваться по ближнему краю репликатора, держать его в чуть (~5-10o) наклонном положении, чтобы ближние иглы были чуть ближе к плашке, чем все остальные. Иглы направлять точно в центр ячеек. При первом переносе лучше перемешать бактерии в плашке репликатором. Старайтесь вращать попеременно в разном направлении, иначе частично лизировавшие бактерии намотаются на иглы репликатора.
  • Двукратный перенос не для того, чтобы перенести в два раза больше материала, а чтобы свести к минимуму вероятность не перенести материал вообще.
  • Одна игла репликатора переносит за раз ~0.2µl среды.
  • В принципе, можно после инокуляции матрицы в ячейки заморозить плашки и хранить их до проведения PCR при -20oС (несколько недель). Но, внимание!!! Нельзя замораживать в сухом льду (надо - либо просто в морозильнике, либо на полотенце, пропитанным жидким азотом). При замораживании в СО2~100% атмосфера углекислого газа сильно сдвигает pH. При наличии сахарозы или бетаина PCR всё равно идёт, но зачем иметь лишние проблемы?
  • п. 9.

  • Лучше всего заклеивать офисной плёнкой фирмы TESA (Tesafilm #2826775): (i) её легко наклеивать и снимать; (ii) заклейка надёжная; (iii) плёнка дешёвая - около 5€ за рулон, которого хватает надолго.
  • Существенно более плохие варианты:
    • "Adhesive Sealing Sheet" от ABgene: (дорогая, очень тяжело снимать);
    • Microseal "A" film. Хрупкая: если слишком плотно зажать крышку ПЦР машины, плёнку можно повредить. Немного сжимается после ПЦР, так что нужно снять верхнюю плёночку ещё в машине. Не выдерживает заморозку (отклеивается);
    • "Bio-stat film". Нужно очень хорошо приклеить (плотно притереть обратной стороной фломастера). Может быть даже полезно положить сверху тонкую резинку. Однако, у лаборантки вполне нормально получался PCR с очень небрежно подклеенной Bio-stat film, при этом испарялось заметное количество ПЦР-смеси, но равномерно по всем ячейкам, а так как крышка прибора закрывается, видимо, герметично, то ячейки высыхают не полностью, а возникает какое-то равновесие.

    п. 10.

  • Для 384-луночных плашек удобно обрабатывать Plate holder by Teflon spray. После этого плашка легко вынимается. Но! предостережение от Алексея Дронова: "Teflon spray не стоит злоупотреблять, а лучше его вообще не применять, так как через некоторое время он образует на плате плохо отмываемый и неприятний слой".
  • Говорят (но звучит разумно), что для 384-луночных плашек лучше уменьшить установленное по умолчанию превышение температуры крышки в 15oС до 5oС.
  • PCR-mix. С той партией 384-плашек, которая была у нас, PCR плохо идёт без добавок (сахароза, бетаин; причём, второй работает лучше). Если попытаться поставить PCR с буфером без добавок, получается (но только в плашках - в параллельном опыте на 8-stips ничего подобного не происходит) шмер различной (в зависимости от конкретной плашки) интенсивности.
  • Добавление сахарозы частично разрешает проблему (иногда, по некоторым дорожкам шмеры всё же заметны). Бетаин снимает проблему полностью.
  • Если использовать "subcycle PCR", выход продукта становится заметно более стабильным (видимо, дело в легкоплавких областях, которые присутствуют в некоторых матрицах). Мы использовали следующую программу:
  • Шаг:Т (oC):Время:
    1951:00
    2940:15
    3590:15
    4650:55
    5go to 32 add. times
    6go to 229 add. times
    76810:00
    840
    9END 

    п.14.

  • Выложить на 4oС в один слой и накрыть сложенным в два-три слоя полотенцем. Продержать в таком состоянии по крайней мере 1.5h, после этого плашки можно выкладывать в стопку.
  • Замораживать так, чтобы холод подводился снизу (на полотенце, вымоченном в жидком азоте или на сухом льду, сверху можно накрыть полотенцем).

    Дополнения, комментарии, вопросы





       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler