Главная страница MolBiol.ru > Методы > Макро-методы > Подготовка к работе spotting gadget Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Чистка и подготовка к работе spotting gadget

 

    Чистка spotting gadget

    работать в перчатках.

  1. поместить иглами вниз в коробочку от желтых типов (чтобы он опирался на бортики);
  2. отвинтить винты, снять верхнюю крышку (вначале чуть приоткрыть с помощью скальпеля, затем действовать отверткой);
  3. пересыпать пружинки в 384-PC плашку;
  4. пересыпать иглы в адаптер, из адаптера - в пластинку-держатель;
  5. разобрать оставшуюся часть gadget;
  6. мыть иглы и две нижние направляющие gadget в ультразвуковой бане (15', 96% EtOH технический);
  7. сушить в воздушном термостате на 65oС, ~15';
  8. собрать две нижние пластины;
  9. пересыпать иглы из пластинки-держателя в адаптер, из адаптера - в gadget;
  10. проверить, что иглы свободно перемещаются на своих позициях;
  11. проконтролировать, что иглы стоят ровно, нет изогнутых, для этого просмотреть иглы по "рядам", "столбцам" и двум "диагоналям";
  12. пересыпать пружинки в gadget из 384-PC плашки;
  13. привинтить верхнюю крышку;
  14. ещё раз проконтролировать (i) легкость хода игл и (ii) нет ли среди игл изогнутых;


  15. Подготовка к работе spotting gadget

    Подготовка к работе заключается в подборе сходных по размеру игл для gadget. В качестве исходного материала используются два (384) набора игл.

    Работать очень аккуратно, чтобы не испачкать прибор меткой.

  16. приготовить 15 ml радиоактивно меченного аналога смеси для споттинга:
  17. Конц.Сток 15ml
    PCR bufer 10x 1x 10x 1.5ml
    NaOH 0.5N 10N 750µl
    Какой либо меченный нуклеотид 2µCi/ml 10µCi/µl 3µl
    H2O   mQ 12.75ml
  18. разлить по 35µl в 384-луночную плашку;
  19. провести споттинг на нейлоновую мембрану с 10-кратным переносом для первого набора игл;
  20. пересыпать иглы (I) в 384-луночную плашку и записать ориентацию игл в плашке;
  21. установить в gadget второй набор игл, провести с ним споттинг на новое поле той же мембраны;
  22. нанести на ту же мембрану по 0.5µl 2x разведений того же радиоактивного тест-раствора;
  23. пересыпать иглы (II) в 384-луночную плашку и записать ориентацию игл в плашке;
  24. получить автограф мембраны, обсчитать количество материала в каждой точке;
  25. в Excel упорядочить иглы по размеру (количеству перенесённого материала), выбрать интервал, дающий минимальный разброс в размерах игл.;
  26. набить gadget иглами из оптимального интервала, кроме того, отобрать по 10 игл непосредственно "сверху" и "снизу" этого интервала, они будут запасными.
  27. провести контрольный споттинг с чернилами (1:100-500 разведение TG1 чернил в аналоге смеси для споттинга), визуально проконтролировать, что размер пятен постоянен.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 7880


    Комментарии

    Общие

  • Проверять gadget нужно с той же смесью (буфер, детергенты и т.п.), с которой предполагается реальная работа, всё отличие . добавленные чернила или метка.
  • Споттинг на бумагу расплывется существенно меньше, чем споттинг на мембрану, поэтому предельную плотность споттинга надо оценивать на мембране.
  • Основная проблема с точностью споттинга возникает в местах контактов "блоков". Поэтому, если при проведении тест-споттинга используются не все позиции, то надо выбирать участок не "внутри блока", а так, чтобы тестировать максимальное количество пограничных контактов.
  • Разница в перенесенном объеме для дупликатов на одном и том же фильтре при 10-кратном переносе обычно лежит в районе 1 %, но изредка может доходить и до 5%.
    • Для gadget 0.4 mm предельная плотность аккуратного "сухого" споттинга - 4х4 (при 5х5 края заметно касаются друг друга; эту плотность можно использовать лишь тогда, когда "наезд" краев значения не имеет).
    • Для gadget 0.25 mm предельная плотность аккуратного "сухого" споттинга - 6х6 (хотя некоторые нецентрированные иглы дают проблемы и при этой плотности). 5х5 – надёжный споттинг.
  • Объем капли, переносимой роботом за один раз для игл с различным диаметром:
  • d [mm]V [nl]
    0.23~1.1
    0.25~1.6 nl
    0.42~6.5

    Этим экспериментальным данным хорошо соответствует формула
    V [nl] ~ 93x(d [mm])3.

  • Так как объем капли, переносимой роботом за один раз V ~ (d)3, где d - диаметр иглы gadget, а площадь пятна S ~ (d)2, то плотность пробы на мембране ~ V/S~d. Другими словами, чем тоньше игла, тем большее количество переносов требуется для достижения одной и той же плотности зонда.
  • Для QBOT: когда плашки устанавливаются в "Stock" их нужно прижимать к левому краю (к тому же, где компьютер).


  • По пунктам

    п. 3.

  • Удобнее, если короткие бортики у 384-PC плашки обрезаны; обязательно пересыпать пружинки над кюветой/пица-боксом, так как их очень легко рассыпать.
  • п. 8.

  • Для полностью металлического gadget, вполне вероятно, что придется временно присоединять ещё и верхнюю и стягивать конструкцию винтами. Нужно следить, чтобы направляющие металлические штыри не выступали снизу из gadget (иначе робот будет упираться ими в "сушилку" и не сможет работать.). Если штыри выступают, то надо вдавить их внутрь с помощью тисков.
  • п. 10.

  • Надавливая снизу рукой в перчатке на иглы, проконтролировать, что иглы свободно соскальзывают вниз. Те, что соскальзывают с проблемами, переместить на другие позиции; обычно требуется переставить 8-16 иголок. Для "тесных" ячеек надо подобрать "тонкие" иглы. Это удобно сделать поставив gadget на ребро; если смотреть внимательно, то можно найти "провисающие" иглы. Они и есть тонкие. Если с ячейкой ничего не удаётся сделать (она тесна для всех игл) - можно взять дрель со слабыми оборотами и сверлом заметно меньшего, чем ячейка, диаметра и "отполировать" ячейку)
  • п. 12.

  • Обязательно пересыпать пружинки над кюветой/пица-боксом, так как их очень легко рассыпать.
  • п. 15.

  • 1х PCR буфер с добавленной щелочью и радиоактивной меткой.
  • п. 23.

  • В дополнительной колонке просчитать функцию ({размер иглы в данном ряду}/{размер иглы в ряду - 384}) – эта функция минимальна на нижней границе оптимального набора из 384 игл.
  • п. 25.

  • Смесь для контрольного споттинга с чернилами нестабильна в сильно щелочном буфере. Готовить перед применением.


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


    Дополнения, комментарии, вопросы





       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler