Главная страница MolBiol.ru > Методы > Макро-методы > Picking Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Перенос индивидуальных бактериальных колоний в 384 луночную плашку - picking

 

    Заранее

  1. приготовить стеклянные шарики (вымыть детергентом, сполоснуть, прокалить или проавтоклавировать);
  2. занять робот на те дни, когда вы собираетесь проводить пикинг;
  3. найти, где в данный момент находится picking-gadget;
  4. приготовить нужное (с маленьким запасом) количество 384-плашек с 2xYT, 7.5% Glycerol;
  5. убедиться, что имеется достаточно 30% H2O2, 95%EtOH, 80%EtOH, стерильной Whatman 3MM бумаги (разрезанной по размеру крышек от 384-плашек);


  6. Высев на 22х22cm чашку Петри

    Провести заранее, чтобы чашки имели возможность постоять на 4oС хотя быON (для чёткой сине-белой селекции).

    Picking начинается ещё при выборе бактериального штамма. Разные штаммы по-разному растут в маленьких ячейках без встряхивания, кроме того, важно, чтобы бактерии имели хорошую клеточную стенку и не разрушались при росте в 384-плашках (в противном случае раствор в ячейке становится вязким и тянется из ячеек нитями за репликатором).

    Говорят, что лучше использовать чашки "Genetix", а не "Nunc". Чашки вымыть детергентом, сполоснуть водой, протереть фильтровалкой. Сушить в ламинаре под UV в течение>20'.

    Важно, чтобы плашки были залиты на ровной поверхности. Заливать в чашку по 200ml 2xYT (или LB) агара. Дать чашкам просохнуть (открытыми в работающем ламинаре) в течение ~1.5h.


    2xYT агар

      200ml 400ml 600ml 800ml
    IPTG 1 M 60 µl 125 µl 190 µl 250 µl
    X-Gal 2% в DMSO 500 µl 1.0ml 1.5ml 2.0ml
    Ampicillin 50 mg/ml 400 µl 800 µl 1.2ml 1.6ml

    В чашку поместить 12 стеклянных шариков. Необходимое количество бактерий (для робота "MEDUZA" ~1000 клонов; для "QBOT" ~400) развести в 2ml 2xYT (или LB), раскапать равномерно по поверхности агара. Распределять (пока не подсохнет) - с помощью шариков, покачивая чашку (нужно трясти энергично, но так, чтобы шарики не подскакивали до крышки. Если библиотека высевается более, чем на одну чашку, то при рассеве лучше пользоваться одним и тем же набором шариков.

    Чашки индивидуально завернуть в SaranWrap и выложить на 37oС в один слой. Растить до того момента, когда колонии достигнут 0.8mm (Не более!!!, мало того, что колонии будут ближе друг к другу, но ещё и робот хуже работает с большими колониями). Дожидаться, пока колонии станут синими не надо - они посинеют на 4oС. Выложить чашки на +4oС в один слой (иначе "средние" чашки будут ещё долго расти).

    Чтобы иметь представление о необходимом для spotting времени: на "MEDUZA" с "хороших" чашек (имеется в виду хорошая плотность - примерно 800-1000 клонов на чашку) можно собрать 10 384-плашек за ~1h 40'.


    Подготовка робота MEDUZA

  7. убрать (если есть) мусор из ниши под чашками; протереть спиртом стёкла, подставку для чашек, площадки для плашек, ближнюю поверхность внутри робота (не протирать шину, по которой робот перемещается - она должна быть смазана маслом);
  8. привести в порядок picking-gadget (выпрямить искривлённые иглы, на иглах могут быть засохшие кусочки агара - снять их влажной марлей/ватой, намотанной на пинцет);
  9. простерилизовать щётку: вымочить 20-30' в свежеприготовленном 0.3% H2O2хорошо сполоснуть водой, поставить на место в робот (лучше пока не заливать её спиртом, чтобы она прошла ещё и UV-стерилизацию);
  10. Medusa Robot
  11. Please Choose on Option
    Pick UV light Spot Cancel

  12. Ultraviolet Light Sterilisation
  13. Sterilisation Time (min): Start
    Time Remaining: Stop
    Cancel
    установить 20';

  14. Pick
  15. Please place the picking gadget securely in the robot head. Cancel OK

  16. Calibration and Test
  17. Calibrate Camera || Test Picking Pins || Calibrate Pins
    Log Out || Cancel || Continue

    Предварительно положить калибровочную плашку. Робот находит на листе точку, затем перемещает "голову" и сравнивает, как соотносится перемещение "головы" с перемещением картинки, снимаемой камерой.

  18. Cancel || Use Calibration
  19. Calibrate hight of Vision Calibration Target
  20. Cancel || Calibrate

  21. Training: lower the robot until the EXTENDED pin is just touching the calibration plate
  22. Axis Jog

    AxisControlPosition 
    LeftRight--
    BackFront--
    RaiseLower--
    Jog by ( )mm   
    Stop!Pin1OK 
  23. Train this Z height
  24. Don’t Train Cancel Train

  25. Please put the pin calibraton fixture into position before continuing
  26. Cancel Continue
    Preparing to make pin strikes
    Cancel Continue
    Pine strikes complete. Please Remove carbon paper before continuing.
    Cancel Continue

  27. Preparing to calibrate. OK
  28. Calibration failed. OK
    Error - returning to last stage OK
    Calibration complete OK
    Возврат в меню "Calibration and Test"


    Пикинг

  29. Когда робот откалиброван, залить в ванночку спирт, установить чашку с бактериями и 384-плашки, снять крышки с первых трёх плашек.
  30. Pick
  31. Picking about to comence.
    OK.

  32. Set up Colonies
  33. Nunc Plate Selection

    Left Plate #:T
    Right Plate #:Q
    Plate Position: разворачивающееся меню
    Picking Parameters:
    Plate Imaging...
    Picking Setup...
    Agar Depth...
    Well Plates...
    Sample Cancel Pick

  34. Plate Imaging - Right Agar Plate
  35. All On
    All Off
    Revetr

    x x x x x x
    x x x x x x
    x x x x x x
               
               
               

    Cancel OK

  36. Picking Setup
  37.   Min Max
    Axis Ratio 0.50 1.0
    Size 70.0 12000.0
    Gray scale 1.0 255.0
    Roundness 0.25 1.0
    Radius Ratio 1.0 1.9
    Blue/White    

    Load...Save...Cancel...OK

  38. Agar Depth
  39. Pin Height Calibration
    Agar Plate Right
    Single level Multi level

    Cancel OK

  40. Prepare to Train Left RONT Corner Z Depth
  41. Cancel Train
    WARNING: Move carefully - a pin is extended!
    Raise it Continue

  42. Train this Z Depth for LEFT FRONT Corner
  43. Cancel Train

  44. MicroWell Plate Available
  45. 19-24 13-18

    On Of
    24 22 20
    23 21 19
    7-12 1-6
    Plate Type
    384 96
    Start Quadrant
    B1 A1
    B2 A2
    Start Pin ( 1 )
    Continue




Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


    Пикинг на QBOT

  1. включить робот: сначала компьютер (переключатель за крышкой в правом углу), робот (зелёная кнопка слева посередине блока), воздух (ON, убедиться, что давление не осталось на нуле);
  2. установить площадку для чашек (винтами к себе);
  3. "Program Manager" -> QBOT;
  4. "Gridding/Picking Qbot" -> OK;
  5. "Initializing drivers, make sure, that power is on"-> OK;
  6. "Make sure all doors are closed"-> OK;
  7. выбрать "Picking";
  8. Установки для проведения picking:
  9. Picking:

    Colours: Blue/White;
    Plates: Right;
    Agar Vol.: 200ml;
    Source plate: Square 23cm;

    spot parameters - Picksels: (z.B.)

    Diameter: ca. 8-140 (размер клонов);
    Min roundness: ca. 0.9;
    Min Axis Ratio: ca. 0.85;
    Max Interframe Spot Error: 20;
    Proximity Detection: 5;

    Microtiter Plate: 384
    First:1;
    384 ell Offset: 1;
    Last Well Offset: 1;
    Last Well Plate: 72;
    Dips to inoculate: 4;
    Time in Wells: 1;

    Treshholds:

    Right Plate: Centre Frame: 0-180;

    Blue Threshhold 10;

    Left Plate: Centre Frame: 0-180;

    Blue Threshhold 10;
    Sterilising Options:

    Cycles in Bath: 1;
    Seconds in Dryer: 7;
    Wait after Drying: 0;

    Additional Options:

    First Picking pin: 1;
    Pause after imaging: +;
    Plate stacker inable: +;



MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 8817

    Дополнения, комментарии, вопросы





       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler