Главная страница MolBiol.ru > Методы > Nest. deletions > С помощью Exo III/MB nuclease Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Получение серийных делеций с помощью DNase I

 

    Линеаризация

  1. резать плазмиду по границе вектор-фрагмент (какая именно рестриктаза - значения не имеет);
  2. проконтролировать рестрикцию на форезе, очистить Ф:Х, Х, переосадить.


  3. Аналитическое расщепление

  4. общая смесь:
  5. Конц.Сток x1 реакцию x7.5
    pDNA     ~0.5µg ~3.75µg
    TrisCl 10x 10mM 100mM, pH 7.537C 2µl 15µl
    MnCl210x 1mM 10mM 2µl 15µl
    BSA 0.1mg/ml 10х 2µl 15µl
    H2O   mQ до V=20µl до V=150µl
  6. приготовить 6 пробирок N1-N6 в бане на 0oС;
  7. разаликвотить смесь:
  8. N1 - 40µl
    N2 - 20µl
    ..........
    N6 - 20µl

  9. к "N1" + 2µl DNase RQ1 0.1u/ml;
  10. смешать, перенести 10µl в следующую пробирку, и т.д.;
  11. 37oС, 1 час;
  12. остановить реакцию: + 2µl буфера для внесения SDS(+)
  13. форез, в качестве контролей использовать:
  14. * ДНК, не обработанную DNase I,
    * линеаризованный вектор;

  15. определить условия {имеется в виду отношение DNA/DNase I} при которых получается наиболее равномерный шмер от плазмиды исходного размера до линеаризованного вектора.


  16. Препаративное расщепление

  17. приготовить смесь:
  18. pDNA => 3-5µg
    TrisCl 10x => 4.0µl
    MnCl2 10x => 4.0µl
    BSA => 4.0µl
    H2O до суммарного => V=40µl
    DNase RQ1 0.1u/ml => ???µl;

  19. 37oС, 55';
  20. добавить
  21. :

    рестриктазный буфер "A*" 10x 4.5µl
    10mM dNTP's2.2µl
    T4 DNA pol.1.0u;

    * =NEBuffer №4.

  22. 37oС, 5', остановить реакцию: + 4µl буфера для внесения SDS(+)
  23. препаративный форез;
  24. выделить DNA из 3-4 зон равного размера (от исходной плазмиды до линеаризованного вектора), особое внимание нужно обратить на то, чтобы не захватить pDNA, не расщеплённую DNase I ни разу.
  25. самолигирование (NT, 2h), трансформация;


  26. Определение размера вставки с помощью PCR

  27. одной и той же зубочисткой снять колонию, перенести её сначала в пустую ячейку PCR плашки, затем - в ячейку многолуночной плашки с 2xYT/G/A/V;
  28. вырастить бактерии: завернуть плашку с бактериями в SaranWrap, 37oС, 6-10h (можно хранить 3-7 дней на +4oС или заморозить на -70oС);
  29. PCR в 10-15µl;
  30. анализ на форезе, подобрать нужные клоны;
  31. высевать 2µl в 2xYT/A/V/K.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 7805

    Растворы

    буфер для разведения DNase I

    (хранить при -20oС):

    Конц.Сток1.7ml10ml
    HEPES, pH7.510mM1M17µl100µl
    Glycerol50%100%850µl
    1.063g
    5ml
    6.25g

    CaCl210mM1M17µl100µl
    MnCl210mM1M17µl100µl
    BSA100µg/ml10mg/ml17µl100µl
    H2O mQ782µl4.6ml

    DNase RQ1 0.1u/ml

    #M6101, Promega: разведение 1:10 000 в буфере для разведения DNase I (при хранении при -20оС активность не изменилась спустя год после разведения).

    2xYT/G/A/V

    (свежеприготовленный):

    Конц.Сток50ml
    2xYT~100%100%46.1ml
    Glycerol7.5%100%3.75ml
    4.73g

    Amp.100µg/ml50mg/ml100µl
    VCSM13107-8pfu/ml~1011pfu/ml~50µl

    2xYT/A/V/K

    (свежеприготовленный):

    Конц.Сток50ml
    2xYT~100%100%46ml
    Glycerol7.5%100%3.75ml
    4.73g

    Amp.100µg/ml50mg/ml100µl
    Kan.70µg/ml50µg/ml70µl
    VCSM13107-8pfu/ml~1011pfu/ml~50µl



Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/



    Комментарии

    Общие

  • Принцип метода:
  • а) pDNA линеаризуется;
    б) DNase вносит двухцепочечные разрывы;
    в) T4 DNA полимераза достраивает разрывы до тупых концов;
    г) самолигирование.

  • Сравнение с "классическим" ExoIII/M.B.
  • преимущества:

    1) !!! нет ограничений на линеаризующую рестрикцию,
    2) существенно ниже требования к качеству pDNA,
    3) более простые ферментативные манипуляции (всё в одной пробирке).

    недостатки:

    доля колоний, на которых PCR "не идёт", заметно больше;

  • NB!:
  • Cтоит заметить, что на практике фракционирование по времени ExoIII/MB реакции не обеспечивает хорошего фракционирования по размерам. Другими словами, как это ни странно, методы не слишком различаются по тому, сколько клонов требуется взять на PCR для того, чтобы получить весь набор серийных делеций.

    По пунктам

    п. 2.

  • Важно, чтобы рестрикция прошла полностью, иначе не резанная плазмида может создать высокий фон.
  • п. 3-11.

  • В ходе аналитического расщепления определяется то соотношение DNA/DNase I, при котором получается наиболее равномерный шмер от плазмиды исходного размера до линеаризованного вектора.
  • п. 12-18.

  • Переход к препаративному расщеплению не сложен, т.к. оно отличается от аналитического только заполнением концов с помощь T4 DNA pol.
  • п. 17.

  • pDNA, не расщеплённая DNase I ни разу, идёт заметным бэндом. Это означает, что соответствующие молекулы имеют большую молярную долю, чем молекулы других размеров => если захватить бэнд, они дадут сильный фон.
  • п. 19.

  • Объем бактериальной культуры зависит от размера тех плашек, которые вы используете: обычно 25-50µl вполне достаточно.
  • п. 20.

  • Плашка со средой заматывается в SaranWrap для того, чтобы среда не подсохла на 37oС. Возможны варианты: пакет, парафильм, tape и т.д.
  • п. 22.

  • Определить точный размер вставок с одного прогона сложно, особенно, если анализируется множество клонов. Мы проводим анализ следующим образом:
    1. на общем форезе определяем "приблизительный" размер фрагментов;
    2. отбираем несколько избыточное количество (~ в 1.5 раза) клонов с различным размером;
    3. проводим проверочный форез, нанося клоны в порядке убывания размера. При таком нанесении сравниваются размеры фрагментов, идущих по соседним дорожкам, поэтому ошибка минимальна.

    Дополнения, комментарии, вопросы





       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler