Главная страница MolBiol.ru > Методы > Цианобактерии > Выделение ДНК Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Выделение геномной ДНК из цианобактерий

Костя Иночкин
Институт Физиологии Растений им. К.А. Тимирязева
www.inochkin.ru

с использованием NaI (large scale)

  1. вырастить 250ml культуры до OD730=1.5;
  2. ЦФ 3krpm, 4oC, 10';
  3. супернатант слить, осадок ресуспензировать на вортексе в 4ml насыщенного раствора NaI;
  4. 37oC, 20';
  5. довести водой до 40ml;
  6. ЦФ 3krpm, 4oC, 10';
  7. ресуспензировать в 9.5ml буфера TNE,
  8. добавить 1.5ml лизоцима (конц. 50mg/ml),
  9. (optional) добавить 15µl 10mg/ml RNase;
  10. 37oC, 45';
  11. добавить 1ml 10% N-лаурилсакрозина или SDS;
  12. (optional) добавить Proteinase K до конечной концентрации 0.1µg/µl;
  13. 37oC, 20';
  14. 2-3 раза экстрагировать Ф:Х (ЦФ 3krpm, NT, 10');
  15. осадить ДНК 0.6-1х объемом изопропанола (-20oC, 10');
  16. ЦФ 15krpm, 4oC, 10'
  17. промыть 70% этанолом;
  18. растворить в TE.

    с использованием STET (без фенола)

    автор этой методики - В.В. Зинченко,
    кафедра генетики, МГУ

  1. вырастить 50ml культуры до OD730=1.2-2;
  2. ЦФ 3krpm, 4oC, 10';
  3. собрать клетки в эппендорф;
  4. промыть в 1.5ml буфера Трис/ЭДТА;
  5. ЦФ 15krpm, 4oC, 1';
  6. супернатант слить, добавить 270µl STET, суспензировать;
  7. добавить 15µl хлороформа, мешать 3'(трясти на шейкере или руками);
  8. добавить 30µl лизоцима (50mg/ml);
  9. 37oC, 30';
  10. добавить 100µl 10% SDS;
  11. 65oC, 40';
  12. добавить 100µl 5М NaCl;
  13. 65oC, 20';
  14. для увеличения объема добавить ~200µl 1М NaCl;
  15. добавить 500-600µl (1 объем) хлороформа или смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:1), мешать 3' (трясти на шейкере или руками);
  16. ЦФ 15krpm, NT, 10';
  17. повторить 3 раза экстракцию п.15-16;
  18. чтобы высадить ДНК, к водной фазе добавить 0.5ml (1 объем) изопропанола;
  19. NT или 4oC, 15-20';
  20. ЦФ 15krpm, 4oC, 10'
  21. промыть 70% этанолом;
  22. растворить в 50µl воды.

    с горячим фенолом

  1. вырастить 50ml культуры до OD730=1.2-2;
  2. ЦФ 3krpm, 4oC, 10';
  3. собрать клетки в эппендорфы;
  4. добавить 550µl кислого фенола;
  5. добавить 600µl воды или TE;
  6. хорошо ресуспензировать клетки, трясти на вортексе 2-3';
  7. 65oC, 10', встряхивать эппендорфы каждые 2';
  8. ЦФ 15krpm, 4oC, 10';
  9. верхнюю фазу перенести в свежий эппендорф, добавить 1 V фенол-хлороформовой смеси, трясти 1-2';
  10. ЦФ 15krpm, 4oC, 7';
  11. повторить экстракцию п.9-10 2-3 раза;
  12. супернатант отобрать в свежий эппендорф, добавить 2-2.5 V этанола;
  13. NT или 4oC, 15-20';
  14. ЦФ 15krpm, 4oC, 10';
  15. промыть 70% этанолом;
  16. осадок ресуспензировать в 100µl RNase (10mg/ml);
  17. 37oC, 30';
  18. добавить 100µl ТЕ для увеличения объема;
  19. экстрагировать ДНК фенол-хлороформовой смесью;
  20. осадить ДНК 96% этанолом;
  21. промыть 70% этанолом;
  22. развести в воде или ТЕ.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 12784

    Растворы

    NaI

    2g NaI /1ml воды, желательно каждый раз готовить свежий. Если хочется приготовить и потом хранить при 4oC, то можно сделать как описано здесь.



    TNE

    (лучше готовить каждый раз свежий)

    Мне почему-то казалось, что TNE — это стандартный буфер, однако выяснилось, что в статьях он везде разный, и поэтому я приведу тот, которым мы пользуемся (готовится из 1М Tris-HCl, 3 или 5 М NaCl, 0.5 М EDTA-Na2):
    50mM Tris-HCl, рН=8.0
    50mM NaCl
    5mM EDTA-Na2, рН =8.0


    Трис/ЭДТА

    (хранить при 4oC)

    50mМ Tris-HCl, рН=8.0
    50mМ EDTA-Na2, рН=8.0


    STET

    (хранить при 4oC)

    8% сахароза
    5% тритон Х-100
    50mМ EDTA-Na2, рН=8.0,
    50mM Tris-HCl, рН=8.0.




Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/



    Комментарии

    Общие

  • У цианобактерий прочная клеточная стенка, поэтому протоколы для прокариот вроде E.coli здесь не годятся. Обработка клеток NaI, лизоцимом, STEТ и так далее направлена на то, чтобы разрушить эту стенку.
  • Протоколы многократно опробованы на Synechocystis. Первый (с NaI) обычно используется в максипрепах, однако мы пробовали модифицировать его для работы в эппендорфах и с меньшим количеством культуры, уменьшив соответственно все параметры. При отстутствии нужной центрифуги так можно делать, но по нашему опыту эффективность метода снижается.
  • Второй (со STET) лучше использовать для работы с небольшим объемом культуры. Плюс — отстутствие в протоколе фенола, при этом ДНК получается довольно чистая.
  • Полученная ДНК годится для основных молекулярно-биологических исследований (ПЦР, Саузерн и т.д.). Выход сильно варьирует в зависимости от штамма, состояния культуры и так далее, так в общем для всех не скажешь.
  • Работа занимает приблизительно 1 день. В принципе, можно прерваться и закончить работу на другой день на стадиях:
    • (1) п.3 — супер слить, а осадки заморозить на -20oC или -80oC;
    • (1) п.16 — можно оставить в морозилке на ночь;
    • (2) п.5 — супер слить или отсосать вакуумным насосом, осадки заморозить на -20oC;
    • (2) п.18 — можно оставить в холодильнике на ночь;
    • (3) п.3 — супер слить, а осадки заморозить на -20 или -80oC;
    • (3) п.13 можно убрать на ночь на -20oC.
  • По пунктам

    (1)

    п. 1.

  • Для Synechocystis обычно занимает 36-48 часов при засеве с плотностью ОД730=0.1-0.2, среда BG-11, 34oC, при постоянном барботировании воздухом с СО2 (1% vol/vol), освещение 70µmol фотонов m-2*s-2.
    Вообще, скорость роста и качество культуры сильно зависит от того, какая цианобактерия, какой штамм, в каком состоянии. Главное — дорастить ее до физиологического оптимума. Так-что этот вопрос каждый экспериментатор решает сам, исходя из свойств культуры.
  • п. 13.

  • Должен получиться вязкий зеленый лизат. Вязкость можно уменьшить пипетированием (для этого нужно использовать обрезанный носик на 1ml). Если лизат непрозрачный, скорее всего, изначально было взято слишком много клеточной культуры; можно попробовать поставить на 37oC еще на 20'.



  • (2)

    п. 2.

  • Обычно это делается в 50ml пластиковых пробирках, но можно открутить в центрифужных стаканах на 100-250ml и так далее, главное — собрать клетки.
  • п. 4.

  • Сначала добавить 0.5ml, ресуспензировать, затем добавить еще 1ml.



  • (3)

    п. 18 — 22.

  • Эти пункты не обязательны, если ДНК нужна для экспериментов, где РНКаза в растворе не мешает.

    Дополнения, комментарии, вопросы





       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler