Главная страница MolBiol.ru > Орг. вопросы > Для студентов > Стерильная работа Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Стерильная работа

Чем лучше моешь лабораторную посуду, тем меньше у тебя потрясающих открытий.
(сказал кто-то из великих).
/эпиграф прислал А.Э. Диланович,
врач-уролог/
Стерильная работа это не набор методов, а скорее определённый стиль работы. Под "стилем" мы подразумеваем то, что качество работы определяется в этом случае не "максимальными", а "минимальными достижениями".
     Работать так, чтобы не возникало загрязнений, совсем не сложно, проблема лишь в том, что так нужно работать всегда (вне зависимости от вашего настроения и состояния).

    Основные правила.

  • Правила стерильной работы практически идентичны для бактерий и клеток эукариот. Разница лишь в том, что:
    1. бактерии обычно более терпимо относятся к их нарушению;
    2. очистка ценной бактериальной культуры - существенно более простая задача, чем очистка культуры эукариотической;
    3. стоимость загубленной бактериальной культуры гораздо ниже, чем загубленной эукариотической.
  • Главное правило: постарайтесь организовать работу так, чтобы чистые и "грязные" растворы и инструменты находились друг от друга как можно дальше во времени и пространстве.
    1. разнесение во времени - вначале подготовьте стерильные среды, разлейте их по пробиркам/чашкам и лишь когда работа закончена и стоковые растворы убраны из под ламинара, вносите под него ваши культуры клеток;
    2. разнесение в пространстве - например, требуется стерильными зубочистками перенести отдельные бактериальные колонии в пробирки с ростовой средой. Удобнее и безопаснее, если предметы под ламинаром будут расположены таким образом, чтобы отдельная зубочистка двигалась слева направо и никогда не возвращалась назад:



    Стерильный пинцет. Стаканчик со стерильными зубочистками. Чашка с бактериями. Пробирки с ростовой средой. Мусорница.

  • Под "грязными" подразумеваются либо нестерильные, либо содержащие живые клетки объекты. В этом смысле матрас с эукариотическими клетками, с которым вы стараетесь работать как можно более аккуратно, тоже надо рассматривать как "грязный".
  • Грязь падает сверху, поэтому постарайтесь:
  • - ничего не проносить над открытыми ёмкостями и перевёрнутыми пробками;
    - не оставлять открытыми дольше, чем это необходимо коробки с типами, банки со средами, пробирки, чашки Петри, культуральные матрасы.

  • Особенно внимательно относитесь к тем местам инструментов, откуда грязь способна легко проникнуть в среду:
  • - не прикасайтесь к горлышку рядом с пробкой (удобно использовать крышки из фольги);
    - внимательно работайте с алюминиевым пеналом со стерильными пипетками, доставайте из него пипетки только стерильным пинцетом.

  • При стерилизации автоклавированием и прокаливанием стоит иметь в виду, что
  • - когда вы достаёте какую либо ёмкость из автоклава воздух в ней горячий. При остывании он сжимается и подсасывает воздух снаружи. Нужно, чтобы этот воздух был не слишком грязным.
    - если прокаливается перевёрнутая влажная колба, то водяные пары остаются внутри (молекулярный вес воды меньше, чем воздуха). Когда колба остынет, пар вновь сконденсируется и колба окажется изнутри влажной.


    Что делать, если случился "зарост".

  • Заросшая банка или чашка - это разрыв в стерильной работе. Важно не дать ему распространиться. Правила "локализации" проблемы:
    1. Открывать заросшие ёмкости очень опасно - многие бактериофаги и споры грибов летучи. Нужно не полениться и вылить заросшую среду в туалет и там же сполоснуть банку (если выливать в лабораторную раковину - возможны брызги, а значит - распространение проблемы).
    2. Нужно иметь очень веские причины для продолжения работы с заросшей чашкой. Но даже если такие причины найдутся лучше сделать эту работу как можно более кратковременной. В ЛЮБОМ СЛУЧАЕ НЕ ПОД ЛАМИНАРОМ.
  • При работе с бактериями возможно (у нас ещё никогда не было) появление на чашке очень крупных (0.5-3cm) бляшек бактериофагов. Это не фаг лямбда, и не M13, а очень опасная лабораторная проблема. Такую чашку нельзя открывать ни в коем случае. Её нужно аккуратно поместить в полиэтиленовый пакет и выбросить (даже если чашка стеклянная), причём лучше на улицу, в контейнер.


  • Работа под ламинаром.

  • НЕДОПУСТИМО, чтобы в одном ламинаре проводилась работа с бактериями, дрожжами и клетками высших эукариот. Обычно требуется использовать даже различные комнаты.
  • Если в один и тот же день приходится работать и с бактериями и с дрожжами и с клетками высших эукариот, лучше спланировать день так, чтобы порядок работы был:
  • Высшие эукариоты;
    Дрожжи;
    Бактерии.

  • Порядок работы под ламинаром:
    1. протереть внутреннюю поверхность раствором детергента (или 70-100% спиртом);
    2. поместить под ламинар всё, что потребуется для работы за исключением
    3. а) UV-чувствительных компонентов (обычно ваши клетки),
      б) мусорницы (она слишком грязная для того, чтобы постоянно болтаться под ламинаром, её лучше ставить лишь тогда, когда она действительно нужна);

    4. ~5-10' прожечь UV;
    5. непосредственно работа (вначале сделать всё, что можно без присутствия "грязных" компонентов. Убрать всё ненужное. Внести под ламинар "грязные" компоненты (иногда лучше по очереди);
    6. по окончании работы вновь протереть ламинар раствором детергента (или 70-100% спиртом), выбросить мусор из мусорницы.


    Инструменты и их применение.

    Пинцет, платиновая петля, стеклянный шпатель.

    Стерилизация:

    1. обмакнуть в спирт;
    2. сжечь спирт/прокалить инструмент на пламени горелки*;
    3. охладить**;
    4. (не обязательно) перед использованием шпателя или петли неплохо на всякий случай прикоснуться ими к поверхности агара (петля - ~5'', шпатель - ~30''), чтобы быть уверенным, что они не горячие.

    ________________
    * конечно, можно простерилизовать всю петлю - до пластиковой рукоятки. Но нужно иметь в виду, что массивные металлические части (особенно зажим) остывают медленно и часто разумно ограничиться стерилизацией лишь самой петли (однако, в этом случае и засовывать её в пробирку со средой можно лишь на длину проволочки).
    ** охлаждение металлических инструментов можно ускорить: вновь окунуть раскалённую часть в спирт (но, ВНИМАНИЕ!!!, при этом нужно быть уверенным, что предыдущий спирт действительно выгорел), охладить в нём, а затем быстро пронести над горелкой, лишь бы спирт успел загореться. Спирт сгорит, не успев нагреть инструмент так же сильно, как газовая горелка.



    Зубочистки.

  • Деревянные зубочистки можно стерилизовать как автоклавированием, так и прокаливанием при 120oС. Для выкалывания бактерий можно использовать оба конца (зубочистку держать за середину).


  • Стерильный пинцет.

  • Очень полезный инструмент. Используется для извлечения стерильных зубочисток из стакана, стерильных пипеток из алюминиевого пенала.


  • Стеклянные пипетки.

  • Существенно более дешёвая альтернатива пластиковым. Главный недостаток - нужно очень внимательно следить за тем, чтобы верхний конец пипетки не имел сколов. Сколы могут очень быстро испортить уплотнители у Pipet pump.


  • Стеклянные шарики.

  • Используются для распределения бактерий по 22х22сm2чашкам. После использования собрать, вымыть детергентом, прополоскать, высушить. Стерилизовать прокаливанием (оптом) или автоклавированием (в полипропиленовых 15ml пробирках порциями по 10-15 шариков).


  • Корнцанг.

  • Незаменим при работе с резиновыми пробками.


  • Отсасыватель хирургический (прислала galina).

  • Очень полезен в работе бывает "отсасыватель хирургический" или "отсасыватель медицинский" с ножной педалью.
    1. Позволяет обходиться без сливного стакана при смене среды: к шлангу от отсасывателя присоединяется длинная (примерно 15 см) толстая игла, прокаляется докрасна в пламени горелки и с ее помощью быстро отсасывается среда. Вместо иглы можно пользоваться стерильной пастеркой.
    2. Используя более тонкую иглу можно аналогичным образом отсасывать среду в 96-луночных плашках.
    3. Насос в комплексе со стерильной вакуумной колбой можно использовать для фильтрования сред (но не в коем случае сыворотки).


  • UV.

  • Очень серьёзный стерилизатор. Даже кратковременное (~10-20'') облучение губительно для клеток.


  • Пластиковые чашки Петри.

  • Любая чашка, с которой Вы работаете, должна быть подписана. Чашки подписываются только снизу (со стороны агара). Причину такого выбора проще всего понять сняв одновременно крышки с двух чашек, подписанных сверху.
  • Можно использовать многократно для работы с любыми бактериями. Вымыть, высушить, протереть 70-100% спиртом, поместить открытыми под UV на ~15-30'. Многие (но не все) линии эукариотических клеток так же допускают многократное использование чашек.


  • Пластиковые крышки для бактериальных пробирок.

  • Вымыть, высушить, автоклавировать.


  • Руки.

  • Перед работой помыть, протереть 70% спиртом (100% - сушит кожу). Или одеть перчатки и протирать уже их.


  • Особенности работы с эукариотическими клетками.

  • Лучше пользоваться лабораторным халатом, предназначенным только для клеточного блока.
  • Обязательно использовать сменную обувь, а не ту, в которой ходите по улице.
  • Нужно выделить определённые пипетки и инструменты и не использовать их ни для чего, кроме культуральных работ.
  • Для хранения реактивов и сред использовать либо отдельный холодильник, либо отдельную тумбочку в холодной комнате (их мыть - детергентом, а затем протирать либо спиртом, либо раствором формалина).
  • Опасность "заростов" выше в тёплое время года.


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


Работа с бактериями.

  • С бактериями можно чисто работать "на столе" - без ламинара. Всё, что для этого требуется:
  • - чистое, незахламлённое место (важно вовремя выбрасывать всё, что способно зарасти);
    - отсутствие сквозняков или хлопающих поблизости дверей.

  • Выкалывание бактериальных колоний. Для заражения достаточно один раз обмакнуть зубочистку вначале в колонию, а потом в среду. Если вы очень дотошный человек - после того как вы обмакнули зубочистку в колонию, размажьте налипшие бактерии по стенке пробирки (их видно), затем наклоните пробирку так, чтобы среда дошла до бактериального пятнышка и, действуя той же зубочисткой как скребком, соскоблите пятно в среду.
  • Если предстоит высеять несколько штаммов бактерий с различной устойчивостью к антибиотикам стоит работать с ними по очереди, в порядке возрастания устойчивости (например: вначале высев на среду без антибиотиков, затем только с ампициллином, и в конце - с ампициллин/тетрациклином).


  • Бактериальные чашки Петри.

    Обычно чашка подписывается два раза. Первый раз при заливке:

    (1) среда,
    (2) антибиотики и другие добавки (обычные сокращения - смотри таблицу),
    (3) дата (число и месяц).

    Второй раз при высеве бактерий:

    (4) название плазмиды или библиотеки,
    (5) опять дата.

    среда M9M9 ХлорамфениколCm, Cam
    среда LBLB Смесь антибиотиков "GE"GE
    среда SOBSOB АмпициллинA, Amp.
    среда SOCSOC TetracyclineT, Tet.
    среда NZYNZY IPTGI
    среда YENBYENB X-GalX
    среда 2YT2YT ГлюкозаGlu
    Terrific BrothTB МальтозаM
       ThiamineThi
       CarbenicillinCb
  • Заливка чашек (на чашку диаметром 8см требуется 15-20ml агара):
    1. подписать чашки;
    2. агар довести до кипения и кипятить 0.5-1' (для того, чтобы расплавились маленькие кусочки агара, которые могут при остывании выступать как центры "кристаллизации");
    3. остудить (лучше с покачиванием) до ~50-60oС (банку с такой температурой можно держать в руке 1-2');
    4. если заливается немного чашек:

      * раскапать по чашкам соответствующие антибиотики и добавки (но не X-Gal, так как DMFA быстро растворяет полистирен; его вносить прямо в расплавленный агар сразу после заливки.),
      * заливать чашки "по одной" (вылить 15-20ml агара (на глаз), смешивать 30-60'');

      если заливается много чашек:

      * добавить необходимое количество антибиотиков и добавок прямо в банку, смешать,
      * разлить по чашкам;

    5. после заливки следует оставить чашки на 1.5-2h под работающим ламинаром (или, если ламинара нет - в термостате на 37oС вверх дном, чуть приоткрыв) чтобы агар подсох, иначе (i) после хранения в чашке будет полно влаги, (ii) сложно будет втереть шпателем бактерии (чашка всё время будет мокрой);
    6. замотать парафильмом и хранить перевернув
    7. * чашки без антибиотика - NT, в течение года,
      * чашки с антибиотиком - +4oС, в течение полутора/двух недель;

  • На 8см чашке можно растереть шпателем ~200µl бактериальной суспензии (однако удобнее не превышать 100µl). Растирать нужно только пока поверхность чашки влажная (дальше шпатель начнёт драть агар). Чашки и хранятся, и инкубируются при 37oС вверх дном.


    • /дополнение от "микробиолога"/
      Можно не "сушить" чашки с разлитым агаром в ламинаре или термостате "чуть приоткрыв", а ставить только что разлитые чашки одна на другую "башенкой"(если они пластиковые), тогда верхняя чашка с горячей средой будет греть крышку нижней и никакого конденсата никогда не образуется. Если разлить утром, вечером эти чашки можно использовать. Проверено опытом.


    • /дополнение от azizov/
      В практических бактериологических лабораториях, в том числе и нашей, принято при использовании стеклянных чашек Петри прокладывать между крышкой и чашкой бумажную прокладку (обычно вырезается из газетной бумаги круг на 3-4 см больше диаметра крышки. После розлива сред чашка сначала покрывается бумагой, а потом непосредственно крышкой, в итоге образующийся конденсат будет сорбироваться бумагой. Стерилизация чашек производится вместе с бумагой. Чуть больше хлопот лаборантам, зато меньше проблем с подсушиванием и конденсатом.


    Колбы и пробирки.

  • Должны быть подписаны (название плазмиды, дата). Культуру бактерий в пробирке можно хранить в холодной комнате 1-2 месяца. Допустимые количества среды для посуды различной ёмкости (превышать эту ёмкость просто нет смысла, так как из-за плохой аэрации получится даже меньший выход бактерий):
  • 16ml стеклянная пробирка3-5ml
    100ml коническая колба5-25ml
    250ml коническая колба20-60ml
    500ml коническая колба50-120ml
    1l коническая колба100-250ml
    2l коническая колба300-500ml
    3l коническая колба300-750ml
    5l коническая колба500-1300ml
  • Пробирки устанавливаются в качалке под углом ~45o. Для хорошей аэрации нужно, чтобы крышка позволяла воздуху проникать в колбу.
  • Очень удобно, если у конической колбы в нижней части есть 2-3 вдавливания (очень просто заказать у стеклодува). В этом случае среда перемешивается и насыщается кислородом значительно эффективнее. За равное время культура достигает на 30-50% более высоких плотностей.


  • MolBiol.ru: http://molbiol.ru
    e-mail: redactor@molbiol.ru
    просмотров: 22674

      Дополнения, комментарии, вопросы

      Роман П. /13.07.2005 09:26/
      Интересно с какой целью создавался топик, ведь все правила стерильной работы стандартизированы?....
      Может для того, чтобы узнать кто и как на самом деле работает? Так в разделе "Беседа" кажется были пару историй по этому поводу...



      _julbio_ /11.01.2006 19:44/
      по поводу уничтожения "заросших" культур. тут дело даже не в лени. нужно, по-моему, не просто сливать все это в туалет, а предварительно это все дело убить: в автоклаве или, на крайний случай, в емкости с хлоркой. так все-таки лучше можно избежать разлетания всякой нежелательной гадости. или я не права?



      _Vadim Sharov_ /11.01.2006 21:29/
      1. Если не пользуетесь перчатками в клеточном ламинаре, добавьте несколько капель тинктуры йода (обычный йод из аптеки) в 70 % спирт для протирки рук. Показано, что при такой обработке закрываються потовые железы на руках, минут на 30. После работы используйте витаминный крем для рук. Очень хорош для этого мужской крем после бритья.
      2. Конечно, в перчатках работать лучше, но, работая в перчатках, надо не забывать периодически их обрабатывать спиртом. С другой стороны, работая без перчаток, кожей чувствуешь момент загрязнения.
      3. Целесообразно распределить руки на грязкую и рабочую. Одна всегда в ламинаре, другая работает в "грязной зоне". Донце колбы, матрас держит "грязная" рука, с пробкой и крышкой флакона работает "чистая" рука. Руки встречаются только при обработке спиртом.
      4. Если требуется дабавлять среду во много лунок не лезьте в банку со средой. Перелейте среду в пробирку или чашку Петри и оттуда раскапывайте.
      5. Перед тем как вставить пипетку в пистолет, не забудьте, что деления пипетки должны быть перед глазами.



      Paulina /24.08.2007 14:32/
      У меня вопрос по стерильной работе: Не опасно ли находиться в помещении (работать с м/о) при включённом ультрафиолетовом свете? Или его можно включать только непосредственно перед и после работы?



      ihork /24.08.2007 15:08/
      (Paulina @ 24.08.2007 12:32)
      Ссылка на исходное сообщение  У меня вопрос по стерильной работе: Не опасно ли находиться в помещении (работать с м/о) при включённом ультрафиолетовом свете? Или его можно включать только непосредственно перед и после работы?


      Если глаз не жалко, то можно и при.



      green mouse /27.08.2007 13:48/
      У меня шеф рассказывал, что работал однажды, глядя на железяку, от которой отражался ультрафиолет решил, что если отражается, а не прямой свет, то ничего страшного. После этого ночью пришлось вызывать скорую.



      Гость /08.04.2008 11:38/
      хе хе))отличная мысль выкинуть на улицу в мусорку чашку с какой нибудь заразой)мда)может и правда сначала простерилизовать или спиртиком залить...если спирту жалко-то хотя бы антибиотичком.я надеюсь, что автор просто это подразумевал как само собой!и не написал надеясь на нашу внимательность вдумчивость и догадливость)а вообще спасибо, кое что интересное для себя нашла)
      Мари



      konst07 /07.02.2009 04:01/
      наЩОТ УФ, не только для глаз опасно, но и воздух ионизируется. Ионы весьма опасны для легких, хотя не так заметно, но очень длительные пребывания и многократность весьма опасны



      Vadim Sharov /07.02.2009 12:50/
      Работать с у/ф с м/о? Если Вам себя не жалко пожалейте объект работы.
      Вы же так убъёте свои объекты.



      Крыска /19.02.2009 12:53/
      (Vadim Sharov @ 07.02.2009 12:50)
      Ссылка на исходное сообщение  Работать с у/ф с м/о? Если Вам себя не жалко пожалейте объект работы.
      Вы же так убъёте свои объекты.

      У/Ф обрабаиывают только блондинок в салярии. А нормальные люди его используют исключительно для обработки рабочего места. Объект исследований им также не стерилизуют



      guest: dik /20.02.2009 13:34/
      А если при включенной лампе Вы чувствуете свежий запах как после грозы, то это значит что ПДК по озону превышено и Вы сжигаете свои легкие, причем сразу оба.



      бутанол /23.02.2009 13:10/
      а ультрафиолетовые рециркуляторы не пользуете? и кстати не в курсе где купить каркасную конструкцию с встроенным рециркулятором и насосом создающим избыточное давление - для создания стерильных зон в помещениях?



      guest: Гость /09.04.2009 17:52/
      про всё написали, всё обсудили, а концентрацию агара для чашек не упоминули.. confused.gif



      alkhimmikk /11.03.2010 11:50/
      а можно еще такую же таблицу и для круглых колб, а то лабы разные и условия тоже?
      Спасибо.



      Daemonarchestratygos /11.03.2010 14:22/
      Если перед работой выпить пива, то вероятность дрожжевого зароста существенно возрастает (данные независимых исследований).



      achiffa /08.07.2014 15:56/
      Подскажите, где можно узнать о стерилизации при работе с вирусами и вироидами растений. В частности, интересует достаточно ли стерилизовать пинцеты для отбора проб спиртом и обжигом или нужно что-то другое.








         
    Дата последней модификации: 30/07/13

    ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
    ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

     ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
    --- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
    --- администрирование сервера: Intervipnet ---

    molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

    molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler