Практична Молекулярна Біологія - головна сторінка.
 > Протоколи > Однокомпонентні розчини

Однокомпонентні розчини


  Русская версия
Русская версия

  English version
English version


  Deutsche Version
Deutsche Version

Головна сторінка
Проект
Протоколи
Обчислення
BioMail
Учасники




Rambler's Top100

 
 
 
 
 
 
 
    Про перерахунок рецептів на довільний об'єм:


    Органічні речовини

    Температурна залежність рН для поширених буферів

    Буфер:pKa/20oCdelta pKa/10oC
    MES6.15-0.110
    ADA6.60-0.110
    PIPES6.80-0.085
    ACES6.90-0.200
    BES7.15-0.160
    MOPS7.20-0.013
    TES7.50-0.200
    HEPES7.55-0.140
    Трицин8.15-0.210
    Tris8.30-0.310
    Біцин8.35-0.180
    Гліцилгліцин8.40-0.280

    ATФ

    C10H14N5O13P3Na2 Mw=551.1 g/M; (зберігати при -20oC).

    Конц.Stock1ml
    ATФ0.1M551.1g/M55.1mg
    H2O mQ  

    неперевірена інформація 0.1M ATФ (pH 7.2): 5.71% (w/w) ATФ, 84.86% (w/w) H2O, 9.43% (w/w) 2M Tris основа.

  • довести до рН7,5 додаванням 2М NaOH (~70-80µl);
  • приготувати близько 700µl, розвести у 2000 разів (це є кінцеве розведення у спектрофотометричній кюветі), перевірити оптичну густину:
  • c[M]=A259/15.4x103=A259 1:2000x0.130; потім довести до кінцевого об'єму.


    Бетаїн

    моногідрат C5H11NO2xH2O; Mw=135.2g/M; (зберігати при 4oC).

    Конц.Stock%(w/w)100ml200ml700ml
    Бетаїн135.2g/M5M63.0067.6g135.2g473.2g
    H2O mQ37.0039.74ml79.49ml278.2ml

    p~1.073g/ml


    Крезол червоний

    50mM (зберігати при +4, -20oC):

    Конц.Stock1ml50ml
    Крезол червоний50mM404.4g/M20.2mg1.01g
    H2O mQ   
  • Крезол Червоний - дуже зручний барвник. При концентрації близько 0,2мМ він сумісний з гідролізом рестриктазами, ПЛР, секвенуванням. Його можна використовувати як маркер для електрофорезу.
  • колір барвнику залежить від рН (червоний, коли рН>7,5; жовтий, коли pH <7,5). Можна використовувати Крезол Червоний як індикатор рН (1) для денатурації дволанцюгової ДНК при секвенуванні, (2) для очищення ДНК з агарозного гелю.

  • DTT

    C4H10O2S2 Mw=154.2g/M; (зберігати при -20oC).

    Конц.Stock%(w/w)1ml5ml10ml20ml
    DTT154.2g/M1M14.550.155g0.773g1.55g3.09g
    H2O mQ85.45905 µl4.53ml9.05ml18ml

    p~1.06g/ml

    Конц.Stock1ml5ml10ml20ml
    DTT154.2g/M2.2M0.339g1.696g3.394g6.787g
    H2O mQ     
  • стерилізація через фільтр;
  • не обробляти ДЕПК;
  • ми не знаємо, чому, але багато посібників (можливо, за "Маніатісом") рекомендують готувати DTT у 10мМ ацетаті натрію, рН 5,2.


  • Приготування суміші dNTP

    Швидкий протокол для ~100mM концентрованого розчину.

    1. розчинити усі чотири dNTP (250mg кожного) у 3.676ml H2O;
    2. + 424µl 5M NaOH;
    3. перевірити рН: ~0.5µl на pH-папері.

    Звичайний (точний) протокол для приготування 100mM концентрованих розчинів.

    1. додати необхідну кількість (див. таблицю) H2O та Tris основи 1M (можна прийняти об'єм розчину ~150µl);
    2.   

      Mw

      V(H2O)V(Tris основи 1M)V(кінц)
      dATPC10H14N5O12P3Na2x3H2O589.23.24ml850 µl4.24ml
      dGTPC10H13N5O13P3Na3x2H2O609.23.55ml400 µl4.10ml
      dCTPC9H13N3O13P3Na3x2H2O569.13.44ml800 µl4.39ml
      dTTPC10H14N2O14P3Na3x2H2O584.13.73ml400 µl4.28ml
    3. перевірити рН: ~0.5µl на pH-папері;
    4. перевірити якість та концентрацію (корисно використовувати кінцеве розведення 1:5000 (~20µM). У цьому разі оптична густина буде близько Am~0.3 - найточніша область спектрофотометру).
      Концентрація c[mM]=k1:5000xAm.

    Якість:

    dATP
    pH 7.0
    A250/A260=0.80+0.03
    A280/A260=0.12+0.02
    dCTP
    pH 2.0(!)
    A250/A260=0.45+0.03
    A280/A260=2.10+0.15
    A290/A260=1.60+0.10
    dGTP
    pH 7.5
    A250/A260=1.18+0.04
    A280/A260=0.67+0.03
    A290/A260=0.28+0.03
    dTTP
    pH 7.5
    A250/A260=0.65+0.03
    A280/A260=0.73+0.03

    Концентрація:

     MwAmpHEk (for 1:5000)
    dATP[Na2]589.22597.015.2x103328.9
    dGTP[Na3]609.22537.513.7x103365.0
    dCTP[Na3]569.12802.0 (!!!)13.0x103384.6
    dTTP[Na3]584.12677.59.6x103520.8
          
    ATP [Na4]595.1259 15.4x103 
    CTP [Na4]571.1280 13.0x103 
    GTP [Na4]611.1252 13.7x103 
    UTP [Na4]572.1262 10.2x103 

    Концентрація: c[M]=Amax/E; Amax = максимум поглинання.


    EDTA

    C10H14O8N2Na2x2H2O; Mw=372.3g/M; pH = 8.0 (зберігати при 4oC).

    Конц.Stock%(w/w)50 ml100 ml150 ml250 ml
    EDTA0.5 M372.3g/M16.989.31g18.62g27.92g46.55g
    NaOH~0.5 M40g/M1.821.014g2.028g3.042g5.07g
    H2O mQ81.1944.48ml88.95ml133.4ml222.4ml
    Конц.Stock10 ml50 ml100 ml150 ml250 ml
    EDTA0.5 M372.3g/M1.86g9.31g18.62g27.92g46.55g
    NaOH~0.5 M10M 507µl
    0.674g
    2.535ml
    3.37g
    5.07ml
    6.74g
    7.61ml
    10.11g
    12.68ml
    16.85g

    H2O mQ8.42ml42.12ml84.24ml126.4ml210.6ml

    p~1.096g/ml

  • EDTA нерозчинна при кислих рН. Необхідно поступово додавати луг та контролювати рН.
  • не обробляти ДЕПК.

  • EtBr

    Бромід етидію, C21H20N3Br; Mw=394.3g/M; (зберігати при NT у темряві);

    Конц.5ml10ml50ml
    EtBr10mg/ml50mg100mg500mg
  • розчиняється у H2O, EtOH, хлороформі;
  • що стосується канцерогенних властивостей EtBr. Єдині дані, що ми знайшли у літературі, стосуються тесту на мутагенність (на бактеріях) - 90µg дають такі самі результати, як концентрат диму однієї цигарки.

  • Желатин

    (зберігати при 4oC).

    Конц.Stock10ml50ml100ml
    Желатин2%твердий0.2g1.0g2.0g
    H2O mQ    
  • стерилізація автоклавуванням.

  • Глюкоза

    C6H12O6xH2O, Mw=198.17g/M; 39.6%, p=1.13

    Конц.Stock%(w/w)200ml500ml
    Глюкоза2M198.17g/M35.0779.27g198.2g
    H2O mQ64.93146.6g366.5g

    Гуанідин HCl

    CH5N3xHCl, Mw=95.53g/M

    Молярність 123456
    Гуанідин HCl (g/L)95.53g/M95.53191.06286.59382.12477.65573.18
    H2O (ml/L)mQ924.2854783.7711.7639.8567.2
    Гуанідин Cl %(w/w) 9.3718.2826.7834.9342.7550.26
    H2O %(w/w) 90.6381.7273.2265.0757.2549.74
    p (g/ml) 1.0201.0451.0701.0941.1171.140
  • розчинність: при 25oC -> 8.54M, 5oC->>8M;
  • A260(6M у H2O)<0.03;
  • при обчисленні розчинів можна прийняти "парціальну густину гуанідин HCl" рівною 0,763.

  • HEPES

    Конц.Stock%(w/w)1L

    C8H18N2O4S

    1M238.3g/M22.40238.3g
    H2O mQ77.60825.7ml

    p=1.064

    HEPES, 1M, 1L

    KOH, 5M [ml]pH
    05.25
    0.55.35
    3.55.75
    76.03
    126.24
    226.59
    326.71
    456.88
    507.00
    607.10
    807.25
    92.57.37

    Імідазол

    C3H4N2, (зберігати при 4oC):

    Конц.Stock50ml100ml
    Імідазол2M68.1g/M6.81g13.62g
    H2O mQ   

    Параформальдегід

    PFA (параформальдегід) 37% (для гістохімії він повинен бути свіжеприготованим).

    1. змішати у пробірці з пробкою, що загвинчується:

    PFA (твердий) => 0.37g,
    H2O => 1.0ml
    NaOH (1N) => 14µl;

    2. розчинити, нагріваючи у окропі (нагрівати поки рН не зменшиться до ~7.0 =>~1-3').


    PEG

    H(OCH2CH2)nOH; (зберігати при 4oC).

    Конц.%(w/w)10ml50ml100ml150ml200ml
    PEG600040%37.214.0g20g40g60g80g
    H2OmQ62.796.75g33.75g67.5g101.25g135.0g

    p=1.075.


    PMSF

    (зберігати при -20oC)

    Конц.Stock20ml
    C7H7FO2S100mM174.2g/M0.348g
    Ізопропанол  20ml

    Ретиноєва кислота

    (all trans-R.a., Tretinoin, чуттєва до світла, зберігати при -20oC):

    Конц.Stock16.6ml
    C20H28O210mM300.4g/M50mg
    EtOH >96%16.6ml
  • концентрований розчин 10mM, 1mM робочий розчин у EtOH готується безпосередньо перед використанням (краще додати чистий EtOH до контрольних клітин).

  • Tris Cl

    C4H11O3N; Mw=121.1g/M; (зберігати при 4oC).

    Конц.Stock50 ml100 ml150ml200ml
    Tris-основа1M121.1g/M6.0612.11g18.17g24.22g
    H2O до кінцевої ваги mQ52.03g104.06g156.09g208.12g

    1M: p=1.0406

    неперевірена інформація 2M Tris основа: 22.90%(w/w) Tris основа, 77.10%(w/w) H2O; p=1.058

  • не обробляти ДЕПК;
  • стерилізація автоклавуванням;
  • рН Тріс-буферів залежить від концентрації. Якщо узяти за початковий 50mM розчин:
  • pH(500mM) => + 0.05
    pH(5mM) => - 0.05

  • рН знижується на 0,028 коли температура підіймається на 1oC.

  • Температурна залежність рН для Tris Cl 50mM

    рН при г/літр для 0.05 M
    5°C25°C37°C Tris HCl Tris Base
    7.557.006.70 7.28 0.47
    7.667.106.80 7.13 0.57
    7.767.206.91 7.02 0.67
    7.897.307.02 6.85 0.80
    7.977.407.12 6.61 0.97
    8.077.507.22 6.35 1.18
    8.187.607.30 6.06 1.39
    8.267.707.40 5.72 1.66
    8.377.807.52 5.32 1.97
    8.487.907.62 4.88 2.30
    8.588.007.71 4.44 2.65
    8.688.107.80 4.02 2.97
    8.788.207.91 3.54 3.34
    8.888.308.01 3.07 3.70
    8.988.408.10 2.64 4.03
    9.098.508.22 2.21 4.36
    9.188.608.31 1.83 4.65
    9.288.708.42 1.50 4.90
    9.368.808.51 1.23 5.13
    9.478.908.62 0.96 5.32
    9.569.008.70 0.76 5.47
    9.679.108.79 0.69 5.53

    TrisCl: 250ml 1M

    V HClV HClpH
     010.44
     19.54
     29.26
     39.08
     3.78.98
    5ml 8.76
    6ml 8.67
     108.4
    11ml 8.22
     148.13
    13.5ml 8.06
    14ml 8.04
    15ml 7.97
     177.92
    16.5ml 7.82
    16.7ml 7.8
    17ml 7.77
    18.3ml 7.63
    18.6ml 7.59
     207.75
     237.4

    1M Tris HCl:

    pHTrizma base %(w/w)Trizma HCl %(w/w)H2O %(w/w)
    7.52.3012.3785.33
    8.05.168.6486.20
    8.26.506.8986.61
    8.89.632.8287.55
    9.510.761.0288.22

    Трицин

    C6H13NO5, Mw=179.2g/M;(зберігати при 4oC).

    Конц.Stock50ml
    Трицин1M179.2g/M8.96g
    H2O mQ  

    Для 50ml:

    5N KOHpH
    7.0ml8.30
    7.5ml8.38
    8.0ml8.47
    8.15ml8.5
    8.5ml8.6
    9.0ml8.68
    9.5ml8.78
    10.08.90

    Триетаноламін

    1M (зберігати при 4oC):

    Конц.Stock%(w/w)50ml
    Триетаноламін1M149.19g/M14.697.46g
    6.66ml

    H2O mQ85.3143.34ml

    Сечовина

    CH4N2O, Mw=60.06g/M;

    Молярність 12345678

    CH4N2O(g/L)

    60.06g/M60.06120.12180.18240.24300.30360.36420.42480.48
    H2O (ml/L)mQ950.6905.8861.3817.0771.6726.7681.2635.7
    p (g/ml) 1.0111.0261.0411.0571.0721.0871.1021.116

    CH4N2O %(w/w)

     5.9411.7117.3022.7228.0233.1538.1643.05
    H2O%(w/w) 94.0688.2982.7077.2871.9866.8561.8459.95
  • розчинність: при 25oC: 10.49M, 5oC: ~8M;
  • A260(6M in H2O)<0.06;
  • При обчисленні розчинів можна прийняти "парціальну густину сечовини" рівною 0,763.


  • Кислоти та луги

    Назва:Формула:Mw% (w/w)[M]g у 1L
    реч.
    p [g/ml]ml/L для
    1M розч.
    Гідроксид натріюNaOH4050%19.17631.5352.4
    30.1%10.04001.329100

    Гідроксид калію

    KOH

    56.150%13.57571.5274.1
    23.06%5.0280.61.217200
    Гідроксид амоніюNH4OH35.028%14.82510.8967.6
    Оцтова кислота, льодянаCH3COOH60.199.5%17.410451.0557.5
    Оцтова кислота36%6.273761.05159.5
    Мурашина кислотаHCOOH46.090%23.410801.2042.7
    Соляна кислотаHCl36.536%11.64241.1886.2
    Азотна кислотаHNO363.071%15.9910081.4262.5
    Хлорна кислотаHClO4100.570%11.6511721.6785.8
    Фосфорна кислотаH3PO498.085%18.114451.7155.2
    Сірчана кислотаH2SO489.196%18.017661.8455.6

    NaOH

    Mw=40g/M; (зберігати при NT).

    Конц.Stock%(w/w)50ml200ml300ml
    NaOH10M40g/M69.9020g80g120g
    H2O mQ30.146.45ml185.8ml278.7ml

    10M: 30.10%; p=1.329.

    Конц.Stock50ml150ml200ml
    NaOH1M10M5ml
    6.645g
    15ml
    19.94g
    20ml
    26.58g

    H2O mQ45ml135ml180ml
  • для зберігання краще використовувати пластикові пляшки, бо луги частково розчиняють скло.

  • KOH

    Mw=56.11g/M; (зберігати при NT).

    Конц.Stock%(w/w)10ml50ml100ml150ml
    KOH5M56.11g/M23.052.806g14.03g28.06g42.08g
    H2O mQ76.959.363g46.81g93.63g140.4g

    5M: 23.06%; p=1.217.

  • для зберігання краще використовувати пластикові пляшки, бо луги частково розчиняють скло.

  • Трихлороцтова кислота

    Трихлороцтова кислота,CCl3CO2H Mw=163.39, (зберігати при нормальній температурі, у витяжній шафі).

    Конц.%(w/w)5ml10ml25ml50ml
    TXО100% (w/v)68.785.0g10.0g25.0g50.0g
    H2OmQ31.222.27ml4.54ml11.35ml22.7ml

    Детергенти

    Саркозил

    (зберігати при NT).

    Конц.Stock1ml3ml5ml15ml50ml
    Саркозил10%30%0.333ml
    0.342g
    1.00ml
    1.027g
    1.67ml
    1.712g
    5.00ml
    5.14g
    16.67ml
    17.12g

    H2O mQ0.667ml2.00ml3.33ml10.00ml33.33ml

    p=1.017.


    ДСН

    Додецилсульфат натрію, лаурилсульфат натрію; [CH3(CH2)10CH2SO4]Na; Mw=288.4g/M; (зберігати при NT).

    Конц.Stock%(w/w)100 ml250 ml300 ml400 ml
    ДСН10%(w/v)твердий9.8210g25g30g40g
    H2O mQ90.1891.8 ml229.5 ml275.4 ml367.2 ml

    p = 1.018

  • зважувати у витяжній шафі (краще одягти маску);
  • необхідно нагріти до 60-80oC для полегшення розчинності. Перевірити рН. Якщо рН суттєво відрізняється від нейтрального (~7.2-7.5) - довести додаванням розведеного лугу або кислоти.


  • Органічні розчинники

    Фенол

    C6H5OH; Mw=94.1g/M
    p=1.054, tm= 43, tb= 182, pKa=10.0
    розчинність: 6.816H2O, необмежена 66H2O; необмежена EtOH

    Приготування "кислого" та "нейтрального" фенолу.

    a) з дистиляту:

    1. дистилювати фенол під шаром H2O;
    2. додати воду до об'єму близько 1/10 фенольної фази;
    3. додати 8-гідроксихінолін до 0,1% (відносно фенольної фази) та bMeEtOH (2-меркаптоетанол) до 0,2% (відносно H2O = 0.02% відносно фенольної фази);
    4. ---- на цьому кроці ви отримали "кислий фенол". Зберігати при -20oC (~1 рік); ----

    5. додати до фенолу приблизно рівний об'єм 0.2 M Tris-основи, перемішувати впродовж ~0.5-1год;
    6. злити водну фазу;
    7. + 0.1V 0.1M Tris-Cl, pH 8.0
    8. 0.2% bMeEtOH
    9. перемішувати впродовж ~0.5-1год;
    10. зберігати при 4oC (у темному місці) ~кілька місяців.

    b) з якісного комерційного препарату:

    1. наситити фенол водою (додати 1/5 об'єму);
    2. потім продовжувати відповідно до (а) з п.2

    ______________
    * Для екстракції РНК краще наситити (просто додати) "кислий фенол" наступним буфером: (зберігати при 4oC):

    Конц.Stock100ml
    AcONa, pH 5.150mM3M1.67ml
    EDTA10mM0.5M2.0ml
    H2O mQ96.0ml
  • перевірити рН та довести додаванням розведеної (1:100) оцтової кислоти при необхідності.
  • неперевірена інформація у "Mitchell Group Methods" було вміщено примітку, що кислий фенол є набагато більш стабільним за нейтральний. Вони рекомендують готувати нейтральний фенол у малих об'ємах лише на кілька тижнів.


    EtOH

    CH3CH2OH; Mw=46.1g/M;

    p(w/w) %(v/v) % p(w/w) %(v/v) % p(w/w) %(v/v) %
    0.7892100.00  0.8385.4  0.8960.5 
    0.7999.7  0.8481.4  0.9056.12 
    0.8096.5  0.8577.3  0.9151.71 
    0.804295.0096.80 0.8673.2  0.9247.2 
    0.8192.9  0.867870.0276.96 0.9342.50 
    0.811492.4295.01 0.8769.0  0.9437.6 
    0.817890.0593.31 0.8864.8     
    0.8289.2  0.885562.4070.01    
  • дуже гігроскопічний (зберігати при нормальній температурі у щільно закоркованій пляшці); tmelt.=-117.3oC; tboil.=78.5oC.

  • Конц.Stock300ml
    EtOH70%96%190g
    H2O mQ70ml


    Приготування 100% EtOH

    1. висушити CuSO4 (при 65oC, 1-2 дні) до практично білого кольору;
    2. змішати близько 1/4 об'єму CuSO4 з 3/4 об'єму 96%EtOH;
    3. інтенсивно перемішувати;
    4. залишити на 1-2 дні (CuSO4 "вбере в себе" воду з етанолу).

    неперевірена інформація тест на "100%" етанол: додати краплину етанолу до ксилену. У разі 100% етанолу не повинно з'явитися туману.


"Практична Молекулярна Біологія" http://molbiol.ru/ukr
e-mail: editor@molbiol.ru




Line

на початок
на початок

 

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  портал про стволовые клетки stemcellrussia.com  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
 ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- администрирование сервера: Intervipnet ---
 ·  безоперационная ринопластика от fantasticnos ·  естественное увеличение груди биоимплантами · 


      molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов    Rambler