(жр) Анаэробные спорообразующие бактерии. Роды клостридиум (Clostridium) и десульфотомакулум (Desulfotomaculum)

Материал из Zbio

Перейти к: навигация, поиск


ОГЛАВЛЕНИЕ

В. И. Дуда

т.1 стр.226-248; рис.37-64; табл.31-36 // размещено онлайн с любезного разрешения Армена Леоновича Тахтаджяна

Книги // ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ // БАКТЕРИИ И АКТИНОМИЦЕТЫ





Содержание




Рис. 37. Колонии Cl. sporopenitum. На темном фоне среды они имеют вид белых платочков с изрезанными краями и муаровой поверхностью. Увел. ×4.

Анаэробные микроорганизмы были открыты великим французским ученым Луи Пастером в 1861 году. В то время открытие анаэробов было ошеломляющим для ученых-биологов, полагавших, что жизнь невозможна без дыхания и использования кислорода. Утверждение о существовании анаэробных организмов показалось настолько фантастичным современникам Пастера, что они выступили против него с резкими возражениями. Это свидетельствует о том, насколько смелой, новой была для биологов XIX в. идея о существовании организмов, не нуждающихся для развития в молекулярном кислороде.

После этого события коренным образом изменились представления о разнообразии организации живых существ и энергетических основах жизни. Последующие исследования многих микробиологов показали, что самые различные природные среды, в том числе полностью лишенные молекулярного кислорода, населены множеством микроскопических организмов, принимающих самое активное участие в круговороте веществ на Земле. Кроме того, было обнаружено, что анаэробы могут быть возбудителями ряда опасных инфекционных заболеваний человека и животных. Глубокое изучение обмена веществ анаэробов позволило использовать их в промышленности как продуцентов ряда ценных для народного хозяйства соединений.

Первой анаэробной бактерией, открытой Луи Пастером, была клостридиум бутирикум (Clostridium butyricum) — спороносная палочка, вызывающая маслянокислое брожение углеводов. В дальнейшем оказалось, что спорообразующие анаэробы — не какие-нибудь редко встречающиеся диковинки, а очень широко распространенные по всей поверхности Земли организмы. Вместе с неспороносными формами они составляют большой и удивительно интересный мир анаэробных микроорганизмов, обнимающий почти всю область микробиологии с ее биохимическим и морфологическим разнообразием бактерий. Действительно, анаэробы встречаются почти среди всех известных крупных систематических групп спорообразующих и неспорообразующих форм эубактерий, кокков, хламидобактерий, микобактерий и актиномицетов, вибрионов, спирилл и спирохет. В последнем определителе (1967) французского ученого А. Р. Прево описано до 48 родов анаэробов, входящих в самые различные семейства, порядки и классы бактерий и актиномицетов.


Рис. 38. Край колонии Cl. sporopenitum под микроскопом. Видны скопления клеток в виде «штабелей». Палочковидные клетки расположены радиально: длинной осью они направлены к центру колонии. Увел. ×300.

В данной главе рассказано о спорообразующих анаэробных бактериях, и только об облигатных, т. е. таких организмах, которые не способны развиваться в аэробных условиях, в отличие от факультативных, способных жить как за счет дыхания, используя молекулярный кислород, так и за счет «нитратного дыхания» либо брожения различных органических веществ в анаэробных условиях. Необходимо отметить, что анаэробные спороносные бактерии хуже изучены, чем аэробные, из-за значительных трудностей, с которыми встречаются исследователи при выделении и культивировании анаэробов.

Главным условием для проведения точных экспериментов по физиологии, биохимии, цитологии и генетике микроорганизмов является выделение чистых культур. Получить чистую культуру анаэробов очень сложно. В последнее время были созданы специальные приборы — анаэростаты, в которых микроорганизмы можно культивировать на плотных питательных средах в атмосфере, почти полностью лишенной кислорода. Но и при использовании современных приборов и средств выделение и инкубирование чистых культур с высокой степенью анаэробности является крайне трудным делом. Поэтому, вероятно, подавляющее большинство, например, сульфатредуцирующих, целлюлозолитических и других спороносных анаэробов остаются до сих пор неизвестными. По существу, из этих физиологических групп, широко распространенных в природе, в лабораториях получены лишь единичные культуры.

Колонии анаэробов на агаризованных средах могут иметь самую различную форму, величину и окраску. На рисунке 37 показаны колонии одной из культур анаэробных бактерий — Clostridium sporopenitum. Так выглядят колонии под лупой. А в микроскопе при большом увеличении видно, что колонии состоят из скоплений громадного количества палочковидных клеток бактерий (рис. 38). Вся колония не поместилась в поле зрения, и виден только ее волнистый край. «Штабеля» клеток как бы текут, расползаясь по поверхности питательной среды.


[править] Строение клеток спорообразующих анаэробных бактерий


Рис. 39. Живые клетки Cl. sporopenitum. Видно образование хроматиновых тяжей и проспор. ХТ — хроматиновые тяжи, П — проспоры. Увел. ×2000.

Все анаэробы, образующие споры, имеют довольно крупные палочковидные клетки с закругленными, заостренными, а иногда как бы обрубленными концами. Величина их варьирует в среднем от 2-3 до 7-8 мкм в длину и 0,4-1 мкм в толщину. Среди спорообразующих анаэробов встречаются и гиганты (рис. 39, 40), вегетативные клетки которых достигают 15-30 мкм в длину и 1,5-2,5 мкм в толщину. Такие крупные анаэробы часто встречаются в различных природных субстратах, но выделить и вырастить их в лаборатории чрезвычайно трудно. Одну из таких бактерий удалось получить в чистой культуре сотрудникам кафедры биологии почв Московского университета. Эта культура явилась превосходным объектом для цитологических наблюдений, т. е. изучения тонкого строения клеток в процессе их роста, деления и спорообразования.

Другие, еще более крупные двуспоровые анаэробы, обитающие в кишечнике головастиков, до сих пор не удалось получить в лабораторных условиях ни в виде чистых, ни в накопительных культурах.


Рис. 40. Созревание спор у Cl. sporopenitum. Форма спор цилиндрическая. Увел. ×3200.

Вегетативные клетки у большинства видов анаэробов прямые, у меньшей части изогнутые в виде запятой или даже свернутые в калачики — тороиды (рис. 41). У одних видов клетки располагаются поодиночно, у других соединены в цепочки. Подвижные спорообразующие анаэробы обладают многочисленными перитрихиально (по всей клетке) расположенными жгутиками. Но имеются и неподвижные виды, лишенные жгутиков.

Капсулы вокруг клеток (рис. 42) имеются у некоторых патогенных (болезнетворных) и сапрофитных анаэробов. Вещество капсул состоит из выделяемых клетками специфических полисахаридов. Размер капсул часто в 2-3 раза превышает диаметр вегетативных клеток.

Клеточные стенки. У анаэробных спороносных бактерий состав и строение клеточной стенки в основном такие же, как и у других грамположительных бактерий. При изучении под электронным микроскопом сверхтонких срезов клеток видно, что клеточные стенки представляют собой самый внешний слой клетки, состоящий из гранулярного и фибриллярного материала (рис. 43).


Рис. 41. Вегетативные клетки в виде вибрионов, тороидов и спирилл у Desulfotomaculum sp. (сульфатредуцирующая бактерия). Увел. ×2100.

По толщине клеточные стенки варьируют у разных видов от 200-300 Å до 300-400 Å. Чаще всего у спорообразующих анаэробов они однослойные, но встречаются виды, у которых стенки разделены на несколько чередующихся светлых (прозрачных) и темных (электронноплотных) слоев. Самый верхний слой стенки у некоторых плектридиальных форм имеет упорядоченную кристаллоподобную структуру и состоит из очень мелких субъединиц, расположенных в «шахматном порядке» (рис. 44).

Мембранные систем клеток анаэробов имеют строение, аналогичное описанному в главе «Строение и химический состав бактериальной клетки». У анаэробов, как и у аэробов, мезосомы (разрастания мембраны внутрь клетки) связаны с ДНК, участвуя, очевидно, в делении нуклеоида (аналога ядра). При спорообразовании мезосомы участвуют в образовании септы (поперечная перегородка) (табл. 32 и 33).


Рис. 42. Капсулы вокруг клеток Clostridium. Увел. ×2200.

Ядро. Анаэробы, как и другие бактерии, лишены настоящего ядра, окруженного мембраной и обладающего набором хромосом, ядрышком и ядерным соком. Вместо этого имеется аналог ядра — нуклеоид. Часто нуклеоид называют просто ДНК-содержащей плазмой (рис. 43).

Цитоплазма анаэробов имеет состав и строение, аналогичное цитоплазме аэробов. В цитоплазме некоторых анаэробов содержатся включения запасного питательного вещества гранулезы — крахмалоподобного полисахарида. При окраске йодом в растворе Люголя гранулеза приобретает синеватую или буро-коричневую окраску. На ультратонких срезах это вещество можно увидеть в форме светлых шаровидных включений (рис. 45). Липидные тельца (капли поли-β-оксимасляной кислоты) в цитоплазме облигатных анаэробов встречаются редко.


Рис. 43. Ультратонкий срез клеток Clostridium penicillum. Видны клеточная стенка (КС), нуклеоид со спирально закрученными фибриллами ДНК(Ф), связанные с нуклеоидом мезосомы (М), и цитоплазматическая мембрана (ЦПМ).


Рис. 44. Ультраструктура клеточной стенки у Clostridium sp. увел. ×45000.


Рис. 45. Включения гранулезы в клетках Clostridium taeniosporum. «Окраска» полисахаридов серебром. Отложения зерен серебра видны в светлых шаровидных включениях и в клеточной стенке. Увел. ×45000.



[править] Спорообразование у анаэробных бактерий

Споры представляют собой специфическим образом устроенные покоящиеся зародышевые клетки, выдерживающие влияние высокой температуры, радиации, вакуума, различного рода токсических веществ и других неблагоприятных факторов, приводящих к гибели вегетативные клетки.

Секрет их необычной устойчивости давно интригует ученых, и в последние годы во многих странах развернулись интенсивные исследования процесса спорообразования.


Рис. 46. Молодые, интенсивно делящиеся клетки Clostridium sporopenitum. Видны делящиеся нуклеоиды. Окраска ядерного вещества по методу Романовского — Гимза. Увел. ×3500.

Бактериальные споры образуются эндогенно, т. е. внутри материнских вегетативных клеток. Что заставляет бактерии перейти от вегетативного размножения к спорообразованию? Формирование спор наступает на определенной стадии развития в тот момент, когда в среде исчерпываются пищевые ресурсы (прежде всего источники углерода и азота) и происходит накопление токсичных продуктов обмена веществ. Каков же конкретный пусковой механизм, включающий процесс спорообразования? На этот вопрос ответа пока нет.

Основное назначение спорообразования — перевести культуру в покоящееся (анабиотическое) состояние. Действительно, у зрелых спор обмен веществ находится на крайне низком уровне. Это позволяет бактериям сохраниться при неблагоприятных условиях среды, а при изменении условий в благоприятную сторону снова перейти к вегетативному росту. Для анаэробов (особенно почвенных) крайне важно также, что споры не чувствительны к кислороду. Это позволяет им выжить в аэробных условиях, губительно действующих на вегетативные клетки. Способность бактерий образовывать споры позволяет им оставаться жизнеспособными в течение десятков и сотен лет. Жизнеспособные споры были выделены из египетских мумий, трупов мамонтов и других объектов, где они провели века и тысячелетия.

Таким образом, споры служат целям сохранения вида.



Таблица 32. Спорообразующие анаэробные бактерии.
Схема 1. Процесс спорообразования по данным люминесцентной микроскопии (объяснение в тексте).
Схема 2. Цикл развития спорообразующих бактерий: в — деление вегетативных клеток 1-7 стадии спорообразования: 1 — образование осевого хроматинового тяжа; 2 — образование споровой перегородки (септы); 3 — «поглощение» протопластом материнской клетки септированного участка цитоплазмы с ядром; 4 — формирование кортекса; 5 — начало формирования оболочки споры; 6 — завершение образования оболочки и созревание споры; 7 — лизис материнской клетки и освобождение спор; с — свободная зрелая спора; п — прорастание споры. Темные извитые нити — ДНК, красным цветом обозначены мембраны вегетативной клетки и споры, голубым — цитоплазма, желтым — клеточная стенка, синим — оболочка споры.
Схема 3. Строение зрелой споры: с — сердцевина споры; цпм — цитоплазматическая (внутренняя) мембрана споры; вмс - внешняя мембрана споры; кс - зародышевый слой клеточной стенки; к -кортекс; цс - слой цитоплазмы между внешней мембраной споры и оболочкой; всо — внутренний слой споровой оболочки; нсо - наружный слой споровой оболочки; в — выросты на спорах; п — подушечка, прикрепляющаяся к споре; лс — линзовидная структура, состоящая из гранулярного вещества.



Рис. 47. Клостридиальная форма клеток Clostridium butyricum. Увел. ×3500.

[править] Цитология спорообразования

Молодые интенсивно делящиеся клетки анаэробов содержат нуклеоиды в виде гантелек, или V-образных фигур (рис. 46). Перед спорообразованием деление клеток прекращается, они резко увеличиваются в размерах. В это время происходит накопление большого количества запасного питательного вещества — гранулезы — откладывающегося в виде гранул, из-за чего цитоплазма становится зернистой, а сами клетки раздуваются, принимая вид лимона (клостридии) (рис. 47, 48, 49) либо барабанной палочки (плектридии) (рис. 50, 51). Лишь у части протеолитических анаэробов клетки не меняют своего первоначального вида, сохраняя обычную палочковидную (бациллярную) форму (рис. 52).

Первым признаком наступления спорообразования является изменение морфологии нуклеоидов, принимающих вид шаровидных телец. Далее несколько нуклеоидов сближаются на одном из полюсов клетки, сливаются и образуют продольно расположенный извитый хроматиновый (ядерный) тяж (рис. 53, 54 и схема 1 на табл. 32).


Рис. 48. Клостридиальная форма клеток. Споры снабжены светлыми конусовидными колпачками. Clostridium species, шт. 1. Увел. ×3500.

Зона цитоплазмы, в которой расположен ядерный тяж, превращается далее в проспору. У бактерий с мелкими клетками перед спорообразованием имеются обычно 2 отдельных нуклеоида, которые сливаются с образованием осевой хроматиновой нити. Впоследствии только часть этой нити переходит в спору. Третий тип поведения ядра встречается у многих сахаролитических анаэробов. Ядерное вещество у них имеет вид хроматиновой сеточки, расположенной по всей цитоплазме. Часть этой сеточки стягивается на одном из полюсов клетки с образованием тяжа — центра формирующейся проспоры. С помощью обычного микроскопа можно выделить три стадии формирования споры. Первая — возникновение на одном из полюсов клетки спорогенной зоны, в которой хорошо заметно ядерное вещество в виде светлых палочек (рис. 39). Вторая — спорогенная зона превращается в темную (оптически плотную) овальной формы проспору с четко выраженными контурами. В проспорах ядерное вещество уже не выявляется без применения специальных методов (окрашивание). Третья — проспоры постепенно светлеют, приобретая способность сильно преломлять свет, и теряют способность окрашиваться красителями. Созревшие споры выглядят светлыми, резко преломляющими свет тельцами, обладающими мощной оболочкой (рис. 40). Форма зрелых спор может быть различной у разных видов анаэробов: сферическая, овальная, яйцевидная, цилиндрическая.


Рис. 49. Клостридиальная форма клеток при спорообразовании. Споры со светлыми конусовидными колпачками. Clostridium sp. Увел. ×3500.

В люминесцентном микроскопе при окраске акридиновым оранжевым (люминесцирующий краситель) наблюдается многокрасочное изображение. Вегетативные клетки светятся (люминесцируют) слабым зеленоватым светом. Их ядра ярко люминесцируют зеленым светом (табл. 32, схема 1). Ядерные тяжи в спорогенной зоне сначала зеленые, затем окружаются веществом с красной флюоресценцией. Далее флюоресцирующая красная зона принимает овальную форму, а хроматиновый, расположенный в центре тяж светится желтым светом. При созревании спора резко меняет цвет и начинает светиться ярким зеленым светом. У зрелых спор с хорошо выраженным кортексом (корой) сердцевина споры темная, зеленым светится только оболочка. Меняется также и цвет цитоплазмы материнской клетки (спорангия). Сначала она слабо-зеленого цвета, затем, с момента оформления проспоры, начинает светиться оранжевым светом.

Хроматиновое вещество сначала выглядит в виде компактных шаровидных гранул, а при созревании проспоры заметно разрушение нуклеоидов.

Биологическое значение слияния ядерного вещества перед спорообразованием остается неясным. Слияние хроматина наблюдается и у неспорулирующих вегетативных клеток под влиянием антибиотиков, низкой температуры, высоких концентраций солей и т. д. Во всех этих случаях, как и при спорообразовании, происходит остановка или резкое снижение синтеза ДНК. Отсюда некоторые исследователи делают вывод об отсутствии специфического значения слияния ядерного вещества перед спорообразованием. Другие авторы считают, что подобное поведение ядра имеет определенный генетический смысл. Интересно, что не только цитологические, но и химические анализы также свидетельствуют о необычном поведении ДНК при спорообразовании. Например, в спорах анаэробов нуклеотидный состав ДНК смещается по сравнению с ДНК вегетативных клеток в сторону ГЦ-типа (ДНК в спорах более «богата» такими основаниями, как гуанин и цитозин). Для спорообразующих аэробов, кроме того, показано, что около 40% высокополимерной ДНК перед спорообразованием выделяется из клеток в среду (редукция части хроматина).


Рис. 50. Плектридиальная форма клеток при спорообразовании. Споры с серповидными колпачками. Clostridium sp. Увел. ×3500.

Электронная микроскопия с ее высокой разрешающей способностью открывает много новых деталей процесса спорообразования. Нужно иметь в виду, что принципы формирования изображения в электронном и обычном световом микроскопе значительно отличаются: в обычном используется видимый свет (фотоны), а в электронном — поток отрицательно заряженных частиц — электронов.

Эти различия необходимо учитывать, чтобы правильно оценивать электронно-микроскопические снимки. В обычном микроскопе изображение создается главным образом за счет различий в степени поглощения света разными участками исследуемого объекта, в электронном — в основном за счет рассеяния объектом электронов. Проходя через объект, электроны сталкиваются с атомными ядрами, рассеиваются и задерживаются. Только та часть электронов, которая беспрепятственно пройдет через объект и попадет на флюоресцирующую пластинку (экран микроскопа), сможет создать изображение. Те места на экране, куда попадут электроны, будут светиться. То есть участки клеток, сильно рассеивающие электроны, будут выглядеть на экране темными, а участки, слабо рассеивающие электроны, — светлыми.


Рис. 51. Плектридии, адсорбированные на целлюлозном волокне. (Клетчаткоразрушающие бактерии.) Увел. ×3500.

Биологические объекты (клетки) состоят из веществ, построенных главным образом из легких элементов (C, N, O, H, P, S и др.), поэтому их изображение в электронном микроскопе слабо контрастно — в клетках можно увидеть очень мало структурных деталей. При использовании светового микроскопа это затруднение преодолевается при помощи окрашивания (контрастирования) объектов различными красителями. В электронном микроскопе изображение одноцветное. Чтобы сделать изображение более контрастным, клетки обрабатывают солями тяжелых металлов (свинца, ртути, хрома, урана, вольфрама). Так как атомы тяжелых металлов очень сильно рассеивают электроны, то структуры клетки, поглотившие эти металлы, будут выглядеть темными и контрастными. Соли тяжелых металлов или их окислы принято теперь называть электронными красителями.

Электронную микроскопию в настоящее время нельзя рассматривать только как более утонченный морфологический метод, так как при описании электронно-микроскопических изображений цитологи неизбежно переходят с описания формы на язык химии и физической химии и пытаются объяснить на молекулярном уровне строение и функцию тех или иных структур клетки. Поэтому морфология, «спустившись на субмикроскопический уровень, органически срастается с биохимией и физиологией клетки» (Г. М. Франк).

Целые клетки из-за своей большой толщины непрозрачны для пучка электронов. Поэтому, чтобы выявить внутреннюю структуру, бактериальную клетку разрезают на десятки и даже сотни отдельных ломтиков (срезов) толщиной всего 200-600 Å. Далее эти срезы просматривают в микроскопе.



Таблица 33. Спорообразование у анаэробных бактерий:
1 — Clostridium sporotrichum, инвагинация мембраны и образование септы в начале спорообразования: цпм — цитоплазматическая мембрана; вм - внутренняя мембрана проспоры; нм - наружная мембрана проспоры; мз - мезосомы; н — нуклеоид; м — инвагинирующие мембраны; 2 — Cl. sporofasciens, образование проспоры, окруженной двумя мембранами: нм — наружная мембрана проспоры; вм — внутренняя мембрана проспоры; кс — клеточная стенка; ят — ядерный тяж; 3 — Cl. sporotrichum, начало закладки споровой оболочки: о — листки оболочки; нм — наружная мембрана проспоры; ят — ядерный тяж; кс — клеточная стенка; вм — внутренняя мембрана проспоры; к — кортекс; 4 — Cl. penicillum, нуклеоид в проспоре: о — оболочка проспоры; к - кортекс; э — экзоспориум; цпм — цитоплазматическая мембрана; ят — ядерный тяж; кс — клеточная стенка материнской клетки; 5 — Cl. penicillum, завершение образования споровой оболочки, созревание сердцевины: кс — клеточная стенка материнской клетки; о — оболочка; э — экзоспориум; цпм — цитоплазматическая мембрана; к — кортекс; с — сердцевина споры.


Электронно-микроскопические исследования ультратонких срезов спорулирующих клеток бактерий показали, что формирование проспоры начинается с инвагинации (врастания) цитоплазматической мембраны ближе к одному из полюсов клетки (схема 2 на табл. 32). При этом мембрана продвигается к центру клетки, и полюса ее сливаются с образованием споровой перегородки (септы). В этом процессе участвуют мезосомы, которые как бы спаивают сближающиеся участки инвагинированных мембран (рис. 1 на табл. 33). Септа состоит из двух элементарных мембран. На этом заканчивается вторая стадия спорообразования (если за первую принять образование хроматинового тяжа). Эту стадию можно рассматривать как модифицированное клеточное деление, которое, как известно, также происходит благодаря инвагинации цитоплазматической мембраны и образования септы.


Рис. 52. Бациллярный тип спорообразования у Clostridium sporopenatum. Увел. ×3500.

Следующей стадией является процесс «поглощения» материнской клеткой септированного (отсеченного) участка цитоплазмы с ядром. Этот процесс осуществляется путем роста и продвижения периферических участков мембраны материнской клетки по направлению к полюсу клетки. Затем сближающиеся участки мембраны сливаются и образуется проспора, обладающая двумя элементарными (трехслойными) мембранами — внутренней и внешней (рис. 2 на табл. 33). У одних видов проспора остается в дальнейшем у полюса клетки (терминальное расположение), у других она перемещается внутрь цитоплазмы, занимая центральное либо субтерминальное положение. Таким образом, в конце этой стадии образуется своеобразный двуклеточный организм: внутри цитоплазмы материнской клетки возникает новая клетка — проспора, окруженная, в отличие от материнской, двумя элементарными мембранами. С этого момента начинается новая необратимая фаза развития и метаболизма, заканчивающаяся созреванием споры и гибелью материнской клетки.

Интересно, что, в отличие от четвертой, вторая и частично третья стадии спорообразования обладают еще свойством обратимости. Так, если после образования септы добавить к спорулирующей культуре антибиотик хлорамфеникол, то синтез белков (а значит, и рост мембраны) будет подавлен. Движение периферических участков мембраны, поглощающей отсеченный участок протопласта, будет остановлено. В результате начавшийся процесс спорообразования превратится в обычный процесс вегетативного деления клеток, и между двумя мембранами септы отложится материал клеточной стенки (рис. 55), чего не бывает при нормальном течении спорообразования. Считается, что на четвертой стадии споруляции происходит образование кортикального слоя (кортекса) между внутренней и внешней мембранами проспоры. Сначала кортекс появляется в виде тонкого темного слоя, сходного по структуре и плотности с клеточной стенкой вегетативной клетки. Затем этот слой резко увеличивается в толщине за счет образования более электронно-прозрачного (светлого) слоя (рис. 2-5 на табл. 33).


Рис. 53. Слияние нуклеоидов на полюсах клеток (перед спорообразованием). Clostridium sporopenitum. Увел. ×3500.

На пятой стадии закладывается оболочка споры. Вначале вокруг проспоры на некотором расстоянии от внешней мембраны проспоры в цитоплазме материнской клетки возникают участки темного (электронно-плотного) вещества в виде чешуек. На шестой стадии отдельные листки оболочки удлиняются и, в конце концов, сливаются, образуя сплошной непрерывный плотный слой. Между этим слоем и внешней мембраной проспоры остается отсеченный слой цитоплазмы вегетативной клетки. Поверх первого слоя оболочки может закладываться еще один или два слоя. В этом случае они разделяются на внутренний, средний и внешний слои оболочки. Эти слои различаются между собой по структуре. У некоторых видов внутренний слой оболочки является пластинчатым, а внешний имеет вид плотного толстого слоя. У других видов, наоборот, пластинчатый слой может быть внешним, а более плотный слой — внутренним. Если строение сердцевины очень сходно у разных видов, то строение оболочек спор у них сильно различается как по тонкому строению, так и по количеству и толщине слоев (рис. 56).

После окончательного созревания споры происходит лизис материнской вегетативной клетки — клеточная стенка разрушается, и спора выходит в среду (седьмая стадия).


Рис. 54. Образование ядерных тяжей в процессе спорообразования. Clostridium sporopenitum. Увел. ×3500.

У многих видов анаэробов поверх споровой оболочки обнаруживается еще одна структура — экзоспориум. Он имеет вид чехла, в котором расположена спора (рис. 57). Тонкое строение экзоспориума весьма различно у разных видов (рис. 56). Часто он очень многослоен, например у Clostridium pasteurianum, Cl. bifermentans, Cl. tyrobutyricum и др. В экзоспориуме многих видов анаэробов обнаруживаются слои с упорядоченно расположенными субъединицами. На рисунке 58 показана тонкая структура пластинчатого слоя экзоспориума. Шаровидные субъединицы в этом слое имеют гексагональную упаковку. Иногда рядом расположенные субъединицы сливаются, образуя кольцевидные структуры с порами в центре. Такие слои экзоспориума представляют собой перфорированные пленки-мембраны. Возникает экзоспориум на ранней стадии формирования споры в виде небольшого пузырька на внешней мембране проспоры. Этот пузырек разрастается, превращаясь в чехол, охватывающий спору со всех сторон.

У анаэробов этот чехол не цельный, имеет крупные поры. Иногда через эти поры в цитоплазму спорангия проходят трубчатые выросты споровой оболочки.

Химический состав и роль споровых структур. Сердцевина споры, окруженная слоем кортекса, представляет собой протопласт с собственной мембраной, ядром и цитоплазмой (схема 3 на табл. 32). Сердцевина у зрелых спор является покоящейся вегетативной клеткой. Она характеризуется очень низким уровнем метаболизма. Хотя в ней имеются все необходимые ферменты, их активность каким-то образом подавлена.


Рис. 55. Влияние хлорамфеникола (антибиотика, подавляющего синтез белка) на спорообразование. Остановка на стадии образования септы и превращение спорообразования в процесс вегетативного деления клеток. Увел. ×66000.
Clostridium penicillum. П — проспора, ЦПМ — цитоплазматическая мембрана, КС — клеточная стенка. Увел. ×66000.

Кортекс (схема 3 на табл. 32) состоит из мукопептидов, весьма сходных с мукопептидами клеточных стенок. В кортексе содержится также диаминопимелиновая кислота. Внутренняя плотная часть кортекса, прилегающая к мембране сердцевины, при прорастании спор оформляется в клеточную стенку молодой вегетативной клетки. В спорах обнаруживается в довольно больших количествах дипиколиновая кислота (C7H5O4N) — активный хелирующий агент, соединение, образующее клешневидные комплексы с металлами. Это вещество отсутствует в вегетативных клетках. Из спор дипиколиновая кислота выделяется в виде кальциевой и магниевой солей, играющих большую роль в термоустойчивости спор. Хорошо известно, что споры способны выдерживать высокие температуры и не погибают даже при кипячении. Имеются также доказательства того, что дипиколиновая кислота играет центральную роль в процессе перевода протопласта споры в покоящееся состояние. Но механизм этих явлений не выяснен. Предполагается, что дипиколиновая кислота локализована в кортексе, так как имеется определенная корреляция между образованием кортекса и накоплением в споре дипиколиновой кислоты и кальция. С другой стороны, при разрушении кортекса (в процессе прорастания или механическом разрушении спор) дипиколиновая кислота обязательно переходит в раствор.

Кортекс у зрелых спор, очевидно, играет защитную роль. Он предохраняет сердцевину от литических ферментов, разрушающих клетки. Это предположение подтверждается экспериментами с мутантами, у которых потеряна способность к формированию кортекса. На завершающей стадии спорообразования происходит резкое возрастание активности литических ферментов, полностью разрушающих материнскую вегетативную клетку. Лишенные кортекса споры при этом также лизируются.

Оболочка (или покровы) является уникальной структурой бактериальных спор, не встречающейся у других микроорганизмов (схема 3 на табл. 32). Она в основном состоит из белковых веществ, обогащенных цистином. Объем оболочки достигает 50% от всего объема споры. Вещество споровых оболочек не чувствительно к действию различных литических ферментов. Специфическая для каждого вида бактерий форма спор сохраняется благодаря структурной ригидности оболочек. Оболочка играет также роль защитной структуры, предохраняющей споры от преждевременного прорастания. Споры мутантных штаммов, лишенные оболочек, обычно прорастают непосредственно после выхода из спорангиев в неблагоприятной для роста среде (даже в дистиллированной воде), что приводит к гибели проросшие клетки. Однако роль оболочек спор, так же как и кортекса, остается во многом еще загадочной.

Экзоспориум представляет собой мембрановидную, часто многослойную структуру. Химический состав экзоспориума проанализирован лишь у одной аэробной культуры. О составе экзоспориума у анаэробов данных в литературе нет. Предполагается, что экзоспориум играет роль барьера, регулирующего проникновение различных веществ в спору. В этом отношении необъясненным остается тот факт, что у многих анаэробных бактерий экзоспориум не представляет собой замкнутой системы: в его полярной части, погруженной в цитоплазму материнской клетки, имеются очень крупные поры, или отверстия, диаметром до 0,5 мкм. Некоторые авторы предполагают, что экзоспориум участвует в формировании споровых оболочек. После механического удаления экзоспориума споры остаются нормальными, процесс прорастания у них не нарушается. Роль экзоспориума продолжает оставаться загадкой.



Рис. 56. (Схема.) Строение оболочки спор у различных видов анаэробных бактерий:
Э — экзоспориум, О — оболочка споры. 1, 2, 3 — слои споровой оболочки.


Выросты на спорах. Замечательной особенностью спорообразования у анаэробов является формирование на спорах особых выростов с поразительно разнообразной структурой. Каждому виду анаэробных бактерии свойствен свой тип строения выростов (рис. 59). Этот признак строго специфичен, наследственно закреплен и очень устойчив. Даже у дефектных спор, потерявших способность образовывать оболочку, выросты сохраняются и не меняют своей специфической структуры.



Таблица 34. Спорообразующие анаэробные бактерии:
1 — Clostridium penicillum, трубчатые выросты на спорах; 2 — Cl. sporotrichum, жгутиковидные отростки на спорах; 3 — Cl. taeniosporum, лентовидные выросты на спорах; 4 — Cl. sporopenatum, перистые выросты на спорах; 5 — Cl. sartagoformum, трубчатые выросты на спорах; 6 — Clostridium sp., споры с шипами на поверхности оболочки.


Поражает разнообразие выростов у различных видов анаэробных бактерий. Они могут иметь форму метелок, тонких нитей или жгутиков, трубок различной толщины, разбросанных по всей поверхности споры или собранных в пучок ершиковидных палочек, длинных широких лент, шипов, булавок и образований, сходных по форме с оленьими рогами (табл. 34).


Рис. 57. Зрелая спора Clostridium penicillum. Сердцевина выглядит бесструктурной. Видны многослойный экзоспориум и выросты на оболочке споры. Увел. ×45000.

У Clostridium taeniosporum выросты имеют лентовидную форму. Пучок таких отростков прикрепляется к споре с помощью специального органа — подушечки (схема 3 на табл. 32 и рис. 4 на табл. 35). Выросты появляются на ранней стадии формирования проспоры — перед закладкой кортекса и оболочки; затем они растут, удлиняются, пронизывая цитоплазму, пока не достигнут противоположного полюса клетки. Цитоплазма вокруг выростов постепенно лизируется (рис. 61). Материнская клетка разрушается. На свободных зрелых спорах, вышедших из спорангия, выросты распускаются в виде зонтика (рис. 3 на табл. 34).

На спорах Clostridium saprogenes имеется по одному крупному и сложноустроенному выросту (табл. 35). Он имеет вид длинного толстого жгута-ствола, образующего на конце кольцо, от которого отходят усики — трубчатые палочковидные отростки. Ствол имеет грубозернистую структуру и поперечную исчерченность, мелкозернистые усики обладают капсулярным слоем. Формирование выростов у этого вида можно проследить на целых клетках. Сначала отростки плохо просматриваются, так как они окружены плотными участками цитоплазмы (рис. 1 на табл. 35), затем цитоплазма осветляется и выросты становятся хорошо заметными (рис. 2 на табл. 35). На одном из полюсов клетки четко заметна кольцевидная структура и усики.



Таблица 35. Спорообразующие анаэробные бактерии:
1, 2, 3, — Clostridium saprogenes, выросты в виде султана, разветвляющегося на конце. Видны стадии формирования споры и выростов, заканчивающиеся лизисом клетки и освобождением споры (1, 2 — увел. ×10800; 3 — увел. ×15000); 4 — Cl. taeniosporum, срез споры с лентовидными выростами; видна подушечка, прикрепляющая выросты к споре: п — подушечка, в — выросты, с — сердцевина споры, о — оболочка, к — кортекс.


Следующая стадия — лизис материнской клетки и выход зрелой споры в среду (рис. 3 на табл. 35). У организма, описанного как Bacillus (Clostridium) penicillus (строгий анаэроб), выросты имеют вид пучка толстых трубок, прикрепленных к одному из полюсов споры (рис. 1 на табл. 34). На поперечных срезах спорулирующих клеток четко видны зоны лизиса цитоплазмы вокруг выростов, имеющих вид овальных плотных телец с зернистой структурой (рис. 61).


Рис. 58. Тонкая структура экзоспориума у Clostridium bifermentans. Видны отдельные светлые субъединицы и гексагональные «плитки». Увел. ×384000.

Химической состав и роль выростов на спорах. Сложные по строению отростки на спорах впервые были обнаружены сотрудниками кафедры биологии почв Московского университета. В настоящее время выросты на спорах анаэробов изучаются также во многих лабораториях за рубежом. Описываются новые виды отростков. Наиболее интересным является вопрос о функции (биологической роли) этих споровых структур. Выяснение функции тех или иных клеточных структур — отнюдь не легкое дело. В истории биологии найдется немало примеров тому, что выяснение роли той или иной клеточной структуры занимает много лет (а иногда и десятилетий). Подобные исследования очень увлекательны и имеют большое значение: с каждой новой структурой открываются новые вещества, особые ферменты, нередко совершенно неизвестные биохимические процессы.

Функция выростов на спорах окончательно еще не выяснена. Одни исследователи предполагают, что отростки на спорах — специфические чувствительные (хемосенсорные) органеллы, подающие споре «команду» на прорастание (при благоприятных условиях). Другие считают, что выросты выполняют важную роль в процессе созревания спор, участвуя в формировании споровых покровов и кортекса. Третьи допускают, что выросты на спорах — результат каких-то нарушений в нормальном обмене веществ.

Химические анализы показали, что выросты состоят в основном из белка. В веществе выростов обнаружено 18 различных аминокислот, а также полисахариды и липиды. Оказалось, что по аминокислотному составу и структуре белок выростов сходен с такими белками, как кератин, актин, коллаген. Для того чтобы проделать подобные анализы, нужно было «отрезать» выросты у большого количества спор, а затем очистить от загрязняющих веществ и собрать их вместе. В качестве «ножниц» при этом был использован ультразвук, а собрать микроскопические отдельные отростки удалось с помощью современных высокоскоростных центрифуг.



Рис. 59. Строение поверхностных структур спор некоторых анаэробных бактерий:
Споры без выростов и экзоспориума: 1 — Clostridium felsineum. Споры с экзоспориумом в виде чехла: 2 — Cl. pasteurianum. Споры с выростами различных типов и экзоспориумом: 3 — Cl. sporosetosum; 4 — Cl. sporopenatum; 5 — Cl. saprogenes; 6 — Cl. sporofasciens; 7 — Cl. sartagoformum; 8 — Cl. corinoforum; 9 — Cl. penicillum. Споры с лентовидными выростами, но без экзоспориума: 10 — Cl. taeniosporum.


Очень важным является вопрос о ферментативной активности выростов. В трубчатых выростах Bacillus penicillus выявлена дегидрогеназная активность (т. е. активность ферментов, отщепляющих водород от окисляемых субстратов).

Химический состав и тонкая структура выростов, их локализация в области контактирующих мембран двух функционально различных клеток (материнской клетки и проспоры) позволяют в общем виде заключить, что выросты бактериальных спор представляют собой специализированные структуры, которые ответственны за контакт клеток в системе спорангий — спорта.



Рис. 60. Ультратонкий срез клеток Cl. taeniosporum. Реакция на дегидрогеназы. Стрелками показаны отложения теллура. Видны выросты и светлые шаровидные включения гранулезы. Увел. ×45000.

[править] Колпачки на спорах

Еще одной чрезвычайно интересной особенностью спорообразования у анаэробов является формирование на спорах блестящих колпачков. Эти колпачки на спорах у клостридиального и бациллярного типа клеток имеют конусовидную, а на спорах плектридиев — серповидную форму (рис. 48, 49, 50, 62). Колпачки при наблюдении в фазово-контрастном микроскопе четко выделяются благодаря сильному блеску. Электронная микроскопия показывает, что они имеют ячеистое строение. Множество отдельных ячеек упакованы таким образом на споре, что образуют сотовидную структуру в виде конуса или серпа. Ячейки — это электронно-прозрачные мешочки, заполненные газообразным веществом (газовые вакуоли). Мешочки имеют палочковидную или яйцевидную форму (см. рис. 62). Назначение колпачков состоит, по-видимому, в том, чтобы увеличивать подвижность и плавучесть спор в водной среде, и тем самым способствовать их распространению в природе. Подобно понтонам ячеистые колпачки не позволяют спорам тонуть. Споры с колпачками не удается осадить даже с помощью центрифуг, более того, при центрифугировании они всплывают на поверхность.

Способностью образовывать ячеистые колпачки обладают азотфиксирующие сахаролитические клостридии, сульфатредуцирующие бактерии и специфические почвенные плектридии, распространенные главным образом в почвах гидроморфного ряда.



Рис. 61. Поперечный ультратонкий срез клеток Cl. penicillum. Хорошо заметен лизис цитоплазмы вокруг трубчатых выростов (светлые зоны). Увел. ×96000.

[править] Физиология спорообразования у анаэробов

Причины, вызывающие переход бактерий от вегетативного развития к спорообразованию, длительное время были неизвестны микробиологам. Впервые в нашей стране А. Я. Мантейфель, Н. Д. Иерусалимский провели исследования, вскрывшие факторы, влияющие на образование спор сахаролитическими анаэробами. Оказалось, что спорообразование вызывается исчезновением из среды источников азота, а также накоплением продуктов обмена (например, бутилового спирта). Но чтобы приобрести способность к споруляции, бактерии должны развиваться при нормальных условиях на полноценной питательной среде, содержащей набор аминокислот и факторов роста. Кислотность среды, оптимальная для вегетативного роста, является наиболее благоприятной и для спорообразования (рН 4,5-5,5 для Cl. acetobutylicum и ~7-7,2 для протеолитических анаэробов). Аэрация останавливает споруляцию. Эти данные свидетельствуют о том, что спорообразование является нормальной стадией развития у этих бактерий.

У анаэробов в отличие от аэробных видов исчерпание в среде источников углерода не влияет на процесс спорообразования. Даже добавление к среде глюкозы (5 г на литр) не сказывается на процессе спорообразования. Если культура выращена на полноценной питательной среде и приступила к спорообразованию, то дальнейший перевод клеток в условия полного голодания (например, перенос в водопроводную воду) не только не подавляет, но даже стимулирует споруляцию у некоторых сахаролитических анаэробов (Cl. saccharobutyricum), т. е. для спорообразования не требуется в этом случае поступления питательных веществ из внешней среды (экзогенных источников питания), а для завершения конечных этапов формирования спор используются внутриклеточные запасы. Такой обмен веществ называется эндогенным (или эндотрофным) метаболизмом. Действительно, установлено, например, что белок спор образуется за счет азота белка вегетативных клеток. Однако у протеолитических анаэробов споруляция не поддерживается в среде, полностью лишенной органических питательных веществ. Так, для спорообразования Cl. botulinum требуются аминокислоты — аланин и аргинин, которые используются в качестве источников энергии.


Рис. 62. Ячеистые колпачки на спорах. Видны отдельные газовые вакуоли (мешочки), составляющие колпачок. Cl. caliptrosporum. Увел. ×55000.

Генетический контроль спорообразования. Процесс «поглощения» материнской клеткой отсеченной на полюсе части цитоплазмы с ядерным элементом приводит к образованию новой клетки с двумя мембранами (проспора). Возникает особая ассоциация клеток — двуклеточный организм в общей оболочке, причем одна из клеток — проспора осуществляет свою жизнедеятельность внутри цитоплазмы другой, материнской клетки. Возникает крайне интересная ситуация, где сталкивается деятельность двух генетических центров — ядра материнской клетки и ядра споры. Многие стороны в их взаимоотношениях остаются еще неясными. Но из цитологических, физиологических и генетических наблюдений можно сделать вывод, что эти два ядра «разделяют» между собой обязанности, связанные с контролем над процессами формирования споровых структур.

Так, синтез новых белковых веществ, споровых оболочек, кортекса и экзоспориума осуществляется при активном контроле генома материнской клетки. При этом роль материнской клетки сводится к тому, чтобы как-то отделить от себя дочернюю клетку, оказавшуюся внутри ее цитоплазмы. Но так как удалить проспору за пределы клеточных границ через цитоплазматическую мембрану и клеточную стенку невозможно, то материнская клетка поступает с дочерней по-иному — она изолирует ее от себя путем инцистирования, окружая проспору мощными слоями белковой оболочки и переводя ее в метаболически неактивное (анабиотическое) состояние. Но это все равно не спасает материнскую клетку от гибели. Хотя она и продолжает еще длительное время активно функционировать, даже иногда способна образовать еще одну спору, но все же она не в состоянии вернуться к вегетативному развитию. В результате нарушения обмена веществ в конце концов наступает лизис (разрушение) вегетативной материнской клетки и освобождение спор.

Участие в спорогенезе большого количества ферментов и антигенов, включение новых путей биосинтеза и появление новых специфических клеточных структур показывает, что число генов, контролирующих спорогенез, достаточно велико (по всей вероятности, их больше 100). Некоторые из этих генов функционируют и в период вегетативной стадии развития. До сих пор остается неясным механизм функционирования спорового генома (набора генов, ответственных за спорообразование). Установлено, что споры получают весь свой ядерный материал (ДНК) в готовом виде от материнских клеток. При этом количество ДНК на спору постоянно для данного вида и не зависит от среды выращивания бактерий. Таким образом, этот показатель, вероятно, может служить характеристикой вида и использоваться при систематике спорообразующих бактерий.



Рис. 63. Стадии прорастания спор Cl. sporopenitum. Увел. ×2100.

[править] Прорастание спор

Споры, перенесенные в свежую питательную среду, начинают прорастать. Сначала они набухают, темнеют, затем через образовавшееся отверстие в оболочке споры молодая клетка выходит в среду. При этом слой кортекса разрушается, а споровая оболочка вместе с отростками (если таковые имеются) сбрасывается. У анаэробов проследить за прорастанием, наблюдая за одной и той же спорой, удается только в редких случаях. На рисунке 63 представлена серия фотографий, иллюстрирующих различные стадии прорастания — от потемнения сердцевины спор до выхода молодой вегетативной клетки из споровой оболочки. На последней стадии выхода вегетативная клетка как бы отстреливается. Отверстие в оболочке споры образуется не строго на полюсе споры, а несколько сбоку, и молодая вегетативная клетка при выходе расположена под углом к длинной оси споры. У других анаэробов процесс прорастания может выглядеть иначе.

Особенности прорастания Cl. pasteurianum С. Н. Виноградский (1902) использовал для дифференциации этого вида от других спорообразующих анаэробов. Наконец, три вида клостридиев — G1. pectinovorum, Cl. butyricum и Cl. tetani — отличаются тем, что прорастание их спор происходит внутри спорангия. Клеточная стенка (или часть ее) у этих видов не лизируется, а остается на зрелых спорах, облегая их в виде чехла. Но этот чехол не идентичен по происхождению и строению с экзоспориумом, описанным выше.


[править] Цитологические особенности спорообразующих анаэробов

Морфология и тонкое строение клеток анаэробных бактерий изучены еще слабо. Скудность морфологии клостридиев отмечалась многими микробиологами, изучавшими эту группу микроорганизмов. Лишь в последнее время с помощью фазово-контрастной и главным образом электронной микроскопии получены новые данные по цитологии анаэробов.

Принципиальных отличий в строении клеток анаэробов (в сравнении с аэробными организмами) не найдено. Однако некоторые группы спорообразующих анаэробов имеют определенные цитологические особенности. Так, анаэробные клостридии в отличие от аэробных спорообразующих бактерий не содержат липидных включений — гранул полибетагидроксибутирата (Имшенецкий, 1944). Вместо них у клостридиев и некоторых плектридиев накапливается гранулеза (крахмалоподобное соединение). И еще одной особенностью анаэробов, о которой упоминалось выше, является формирование на спорах анаэробов специфических выростов и ячеистых колпачков.


[править] Физиологические и биологические особенности спорообразующих анаэробных бактерий

Главные отличия анаэробов касаются энергетического метаболизма, т. е. реакций, снабжающих организм энергией, и ферментов, связанных с этими реакциями. Сущность анаэробиоза была кратко и в то же время точно сформулирована Луи Пастером как «жизнь в отсутствие воздуха», т. е. жизнь без дыхания, существующая за счет анаэробного превращения веществ.

Анаэробиоз свойствен и факультативно анаэробным микроорганизмам. В отличие от последних облигатные анаэробы не могут развиваться в присутствии кислорода, более того, кислород в молекулярной форме ядовит для анаэробов.

Как известно, микроорганизмы черпают энергию, необходимую для поддержания их жизнедеятельности, за счет различного рода процессов окисления органических (а иногда и неорганических) веществ. При этом окисление происходит путем отщепления от субстратов водорода (или электронов). Водород переносится по цепи ферментов и в конечном итоге соединяется с кислородом, образуя воду. Анаэробный же способ извлечения энергии характеризуется тем, что свободный кислород в нем не принимает участия, а органические субстраты окисляются только за счет отщепления водорода. Освобождающийся водород либо присоединяется к продуктам распада того же самого органического вещества, либо выделяется в газообразном состоянии.



Таблица 36. Спорообразующие анаэробные бактерии.
Схема 1. Транспорт электронов при дыхании в различных типах анаэробного получения энергии (брожение и анаэробное дыхание).
Схема 2. Изменение окислительно-восстановительного потенциала в питательной среде (МПА, желатин) при доступе воздуха.
Схема 3. Разделение спорообразующих анаэробных бактерий на порядки, семейства и роды (по А. Р. Прево и др.).


На схеме 1 (табл. 36) показан транспорт электронов при дыхании и различных типах анаэробного способа получения энергии. Водород и электроны отщепляются от субстратов с помощью пиридиннуклеотидных ферментов (ПН). Далее они у аэробов проходят по цепи ферментов с возрастающими потенциалами-флавопротеидные (ФП) —цитохромные ферменты (Цит.) — и с помощью цитохромоксидазы (Цит. окс.) переносятся на кислород. Поток электронов направлен от системы с более низким (более отрицательным потенциалом) к системе с более высоким (более положительным) потенциалом, от — 0,8 — 0,4 в (потенциал субстрата) до + 0,8 в (потенциал кислорода).

Таким образом, при дыхании конечным акцептором водорода является кислород. У анаэробов в качестве акцепторов водорода выступают либо органические субстраты (брожение), либо неорганические вещества, такие, как нитраты или сульфаты («анаэробное дыхание»). Из схемы видно, что наиболее просто и примитивно транспорт электронов осуществляется у большинства анаэробов из-за отсутствия у них ферментов цепи переноса электронов, способных передавать электроны по цепочке вплоть до молекулярного кислорода.

Молекулярный кислород отрицательно действует на рост и активность облигатных анаэробов. В присутствии свободного кислорода клетки анаэробов теряют подвижность. Благодаря этой реакции анаэробы были впервые обнаружены Пастером. Однажды он рассматривал под микроскопом каплю бродящей жидкости (при маслянокислом брожении), помещенную между двумя тонкими плоскими стеклышками, и заметил, что клетки, находящиеся по краям препарата (куда кислород воздуха свободно проникал), становились внезапно неподвижными, а палочки, находящиеся в центре препарата (куда воздух не проникал), продолжали очень активно двигаться.

Отсюда Пастер сделал вывод, что кислород воздуха ядовит для некоторых микробов, и разделил последние на две группы — аэробов и анаэробов.

Противники Пастера (например, Трекюль) возражали против утверждения о существовании бактерий, для которых кислород воздуха может быть смертельным, и приводили в пример споры анаэробов, способные длительное время сохраняться на воздухе. На это Пастер отвечал, что споры не являются настоящими живыми существами, так как они не питаются и не размножаются. Последующее развитие науки подтвердило положения Пастера. Так, было показано, что спорам бактерий свойствен крайне выраженный анабиоз и обмен веществ у них находится на таком низком уровне, что его даже не удается измерить с необходимой точностью. В связи с этим споры не чувствительны ко многим повреждающим факторам, а споры анаэробов могут, кроме того (в отличие от вегетативных клеток), легко сохраняться на воздухе.

Вопрос, почему кислород является токсичным для анаэробов, еще недостаточно выяснен. Одни исследователи считают, что токсическое действие кислорода связано с образованием в культурах анаэробных микроорганизмов ядовитых концентраций перекиси водорода, образующейся в результате окисления субстрата кислородом воздуха. Причиной накопления перекиси водорода является отсутствие у анаэробов фермента каталазы (разлагающего перекись). Имеются сообщения, что некоторые штаммы клострндиев могут расти и в аэробных условиях, если к среде добавлена каталаза. Но, с другой стороны, очень важным фактором, определяющим развитие анаэробов, являются окислительно-восстановительные условия среды. Они выражаются через окислительно-восстановительный потенциал (ОВП), измеряемый в вольтах (напряжение на электроде, погруженном в испытуемую среду). Окислительно-восстановительные условия можно выразить также через показатель rH2, характеризующий соотношение между H2 и O2. rH2 в пределах от 0 до 40 характеризует все степени восстановленности или окисленности среды в зависимости от насыщения ее кислородом либо водородом. Подробные исследования условий развития анаэробов показали, что облигатные анаэробы не могут развиваться при rH2 (или ОВП) выше определенного предела. rH2 в среде можно измерить либо электрометрическим способом (с помощью потенциометров), либо с помощью красителей, которые восстанавливаются и обесцвечиваются (или изменяют цвет) при определенных значениях rH2. Так, например, краситель янусгрюн в аэробных условиях при rH2 = 20 и выше имеет в растворе зеленый цвет, при rH2 в пределах 12-14 — розовый цвет, а при еще более низких значениях rH2 он обесцвечивается.

А. Р. Прево проделал следующий опыт (схема 2 на табл. 36). Питательную среду (мясо-пептонный агар или желатин) он наливал в пробирки, кипятил 35 мин и оставлял на воздухе двое суток. Сразу после кипячения среда даже у самой поверхности была сильно восстановленной с низким rH2. Через 48 ч вследствие диффузии кислорода в среду показания rH2 сильно изменились. С самой поверхности и до глубины 10 мм rH2 составлял 20 единиц (янусгрюн — зеленый). Ниже 10 мм rH2 был равен 14 (янусгрюн — розовый). На глубине 13 мм  — 12,5, при 16 мм. — 9,2, а при 17 мм — 8, при 18 мм всего 7,4. Оказалось, что строгие анаэробы могут развиваться в средах с rH2 не выше 14.

Имеются также виды с высокой степенью анаэробности, которые начинают размножаться лишь при крайне низких значениях rH2, приближающихся или почти равных нулю. В области rH2 выше 14 находится зона развития аэробов. В промежуточной области (между аэробиозом и строгим анаэробиозом) могут развиваться микроаэрофильные формы, приспособившиеся к развитию в средах с низкими концентрациями свободного кислорода.

При изучении действия кислорода на развитие облигатных анаэробов было показано, что кислород не оказывает губительного действия на анаэробов, если ОВП среды низкий. Действительно, если к среде добавить восстанавливающие агенты, снижающие ОВП, то некоторые анаэробные микроорганизмы способны развиваться на таких средах в аэробных условиях. В целом анаэробы можно отнести к таким микроорганизмам, рост и развитие которых приурочены к природным субстратам, лишенным свободного кислорода и обладающим низким окислительно-восстановительным потенциалом.

Токсическое действие кислорода воздуха на рост и развитие облигатных анаэробов и тяготение к низкому окислительно-восстановительному потенциалу, по современным представлениям, можно объяснить тем, что молекулярный кислород и высокий ОВП могут служить причиной необратимого окисления жизненно важных ферментов, обусловливающих основные процессы их метаболизма.

Большинство анаэробных спорообразующих бактерий лишено также и других геминовых ферментов. Так, у бактерий из порядков Clostridials и Plectridiales (по Прево) не обнаружены до настоящего времени цитохромы. Для переноса водорода в ряду субстрат — субстрат ими используются флавиновые ферменты, обладающие свойством аутооксидабильности (самоокисление кислородом воздуха). Хотя ферменты облигатных анаэробов (например, флавиновые) окисляются кислородом, он у них не может служить в качестве физиологического акцептора водорода. Реакция флавиновых ферментов с кислородом направлена на детоксикацию молекулярного кислорода.

Из спорообразующих анаэробов цитохромы (цитохромы б и с) обнаружены только у сульфатредуцирующих микроорганизмов рода Desulfotomaculum. Эти бактерии также очень чувствительны к кислороду. Таким образом, различия между облигатными анаэробами и аэробами касаются прежде всего ферментативного обеспечения терминального окисления. У анаэробов свободный кислород не может быть использован в качестве конечного акцептора водорода.

В клетках спорообразующих анаэробов в энергетическом обмене веществ играют большую роль флавиновые ферменты.

Не удивительно поэтому, что содержание флавиновых дегидрогеназ в клетках анаэробов (маслянокислые бактерии) значительно выше, чем у аэробов.

Облигатные анаэробы представляют собой, очевидно, пример ранних анаэробных форм жизни. Это согласуется с теорией происхождения жизни на Земле, по которой первичными организмами нашей планеты были анаэробы. Сравнительный биохимический анализ приводит к выводу, что в основе энергетического обмена всех без исключения организмов лежат одни и те же поразительно сходные между собой цепи реакций, не связанных с потреблением свободного кислорода, — реакции, которые происходят в клетках современных анаэробов (по А. И. Опарину).

В связи с этим большое значение имеет также вопрос о локализации в клетках анаэробных микроорганизмов дегидрогеназ. Считалось, что у аэробов дегидрогеназы связаны с мембранами, а у анаэробов, не обладающих цитохромами и окислительным фосфорилированием (клостридии), эти ферменты не связаны с мембранами и находятся в цитоплазме только в растворимой форме. Эта точка зрения как будто находится в согласии с данными о том, что ферменты гликолитического цикла (ферменты, участвующие в распаде углеводов в анаэробных условиях) находятся в клетках животных в растворимой форме.

Таким образом создавалось впечатление, что механизмы, обеспечивающие анаэробиоз, в структурном отношении организованы более примитивно. Свидетельством этого является отсутствие в данном случае связи дегидрогеназ с мембранами. Однако недавно было показано, что ферменты гликолитического цикла (в том числе дегидрогеназы) локализуются в плазматической мембране.

Ошибочность прежних данных объяснялась грубостью методов выделения мембран для биохимических анализов. Выделение чистых фракций мембран включает жесткие приемы разрушения клеток и последующее разделение осколков клеток на фракции различных клеточных структур. В процессе таких обработок ферменты, связанные с мембранами, могут легко от них отделиться. Как отмечают известные биохимики Д. Грин и Р. Гольдбергер (1968), именно эта хрупкость мембран вводила в заблуждение два поколения биохимиков, которые считали, что гликолитические ферменты не связаны с мембранами.

Применение электронно-микроскопических методов, позволяющих изучать распределение дегидрогеназ в целых клетках, показывает, что дегидрогеназы у анаэробных спороносных бактерий, очевидно, также связаны с мембранами, играющими у живых организмов огромную роль, особенно в процессах энергетического метаболизма. Например, у такого облигатного анаэроба, как Cl. taeniosporum, активность окислительно-восстановительных ферментов проявлялась только в связи с цитоплазматической мембраной (рис. 60). В то же время у других анаэробов восстановление акцепторов электронов наблюдается и в цитоплазме. Возможно, эти явления связаны с различным набором ферментов у разных видов либо с неспецифическим восстановлением красителей в цитоплазме.

В качестве индикаторов для окислительно-восстановительных ферментов в электронной микроскопии используют теллурит калия или соли тетразолия. Эти соединения, будучи добавленными в среду и проникая в клетки, акцептируют электроны, которые они получают от дегидрогеназ. В результате реакции эти соединения восстанавливаются и выпадают в осадок, имеющий вид электронно-плотных (темных на экране микроскопа) зернышек, глыбок, тонких слоев. Теллурит в качестве индикатора окислительно-восстановительных ферментов более показателен, чем тетразолии, так как соли тетразолия могут неспецифически восстанавливаться веществами, содержащими сульфгидрильные группы, а также редуцирующими (восстанавливающими) сахарами. Особенно это относится к анаэробным микроорганизмам, развивающимся при очень низком окислительно-восстановительном потенциале среды и вырабатывающим различные вещества с сильной редуцирующей активностью. Весьма интересно, что у некоторых анаэробных бактерий рода Clostridium обнаружена специфическая, но эффективная форма окислительного фосфорилирования (фосфорилирования в цепи окислительных ферментов).

Если согласиться с утверждением (довольно убедительно обоснованным данными сравнительной физиологии и биохимии) о том, что облигатные анаэробы — это пример ранних форм жизни на Земле, то возникает вопрос, не отразились ли происхождение и эволюция анаэробов на составе и строении их ДНК — хранителе генетической информации. Сейчас уже хорошо известно, что дезоксирибонуклеиновым кислотам всего органического мира присущ единый план строения, а с другой стороны, имеются безграничные возможности вариаций состава и структуры этих соединений. Вполне логично думать, что возникновение ДНК в истории жизни на Земле было весьма важным и, вероятно, даже решающим фактором в дифференциации и обособлении новых групп и видов живых существ. Так как именно нуклеиновые кислоты непосредственно связаны с наследственностью и изменчивостью, то они должны являться материальной основой эволюционного процесса.

Специфичность нуклеиновых кислот для различных организмов обусловливается их химическим строением и может отражаться в первую очередь на количественном соотношении пуриновых и пиримидиновых оснований (на нуклеотидном составе) и на последовательности чередования нуклеотидов в цепи молекулы. Состав ДНК бактерий очень сильно варьирует от самого крайнего АТ-типа (преобладает пара — аденин и тимин) до ГЦ-типа (преобладают гуанин и цитозин). Если выразить соотношение оснований в виде молярных процентов Г + Ц, то колебания этого показателя лежат в пределах от 25 до 75%. Весьма показательно в этом отношении, что сложно организованные прокариотные организмы — актиномицеты — имеют самый высокий процент Г + Ц в ДНК, а примитивные анаэробные спорообразующие бактерии, у которых отсутствуют цитохромы, обладают крайним АТ-типом (до 25% Г + Ц). Средиспорообразующих анаэробов также можно выявить определенные закономерности. Так, для гетеротрофных, не содержащих цитохромов бактерий (клостридии) колебания Г+Ц находятся в пределах от 25 до 39%, а для спорообразующих сульфатредуцирующих анаэробов, являющихся хемолито-гетеротрофами и обладающих уже отдельными цитохромами, процент Г + Ц находится в пределах 45-48.

Таким образом, ДНК у анаэробов имеет интересные особенности, и очень многого можно ожидать в будущем от изучения первичной структуры ДНК этих бактерий.


[править] Физиологические группы анаэробных спороносных бактерий

Облигатные анаэробные бактерии, способные образовывать эндогенные споры, в настоящее время можно подразделить в зависимости от характера используемых ими субстратов и особенностей метаболизма на следующие физиологические группы: сахаролитические, протеолитические, пуринолитические и сульфатредуцирующие анаэробные бактерии.


[править] Сахаролитические анаэробные бактерии

Сахаролитические анаэробные бактерии способны сбраживать различные углеводы (органические кислоты и спирты, полисахариды, пектиновые вещества). Обычно конечными продуктами брожений являются органические кислоты, растворители (спирт, ацетон, бутанол и др.), углекислый газ и водород. Было установлено существование нескольких типов брожения.

Маслянокислое брожение осуществляют такие анаэробы, как Cl. butyricum, Cl. tyrobutyricum, Cl. lactoacetophilum, и другие виды. Главные продукты брожения — масляная и уксусная кислоты. Так, сбраживание глюкозы Cl. butyricum можно описать уравнением


4 глюкоза → 2 уксусная кислота + 3 масляная кислота + 8CO2 + 8H2


Образование масляной кислоты происходит также, если в среду вместо углеводов вносить молочную кислоту вместе с уксусной. Уксусная кислота играет роль акцептора водорода. Образовавшиеся при маслянокислом брожении кислоты далее микроорганизмом не потребляются.

Ацетонобутиловое брожение представляет собой биохимически более сложный тип маслянокислого брожения, в котором образовавшиеся на первой стадии жирные кислоты превращаются в нейтральные конечные продукты — ацетон, бутиловый и изопропиловый спирты. Если в первой фазе брожения увеличивается кислотность, то во второй фазе кислотность не только не возрастает, но даже уменьшается. Таким образом, за счет превращения кислот в нейтральные продукты регулируется рН среды (кислотность). Ацетонобутиловое брожение углеводов вызывается Cl. acetobutylicum и близкими к нему по физиологии видами. Cl. butylicum осуществляет брожение, очень сходное по типу с ацетонобутиловым, но отличается тем, что вместо ацетона в этом случае образуется изопропиловый спирт.

Уксуснокислое брожение углеводов наблюдается у Cl. aceticum и Cl. thermoaceticum. Уксусная кислота — единственный продукт брожения.

Пропионовокислое брожение присуще С1. propionicum. В качестве основных продуктов образуются пропионовая и уксусная кислоты, а также углекислый газ.

Брожение пектиновых веществ (полиурониды) способны осуществлять анаэробные бактерии из различных систематических групп. В настоящее время известно около 18 видов клостридиев, способных разрушать пектиновые вещества. Наиболее активные пектинолитические виды — Gl. felsineum, Cl. laniganii, Cl. pectinolyticum, Cl. pectinovorum, Cl. virens и другие пигментированные и непигментированные клостридии и плектридии. Имеются и факультативно-анаэробные формы — С1. macerans и Cl. polymyxa. Каждому из этих видов свойственны свои специфические детали обмена веществ, но общим их свойством является способность разлагать пектиновые вещества до органических кислот, спиртов и газов. Некоторые бактерии обладают очень стойкими пектинолитическими свойствами и выделяют пектинолитические ферменты на средах без пектиновых веществ. У других анаэробов (например, у Cl. multifermentans) синтез ферментов происходит только при добавлении в среды пектинов (индуцированный синтез ферментов).

Сбраживание Сахаров пектинолитические анаэробы осуществляют по маслянокислому или ацетонобутиловому типу.

Брожение целлюлозы. Большая группа высокоспециализированных анаэробных спорообразующих бактерий получает энергию за счет сбраживания целлюлозы. Конечными продуктами брожения являются уксусная, пропионовая, масляная и молочная кислоты, этиловый спирт, водород и углекислый газ. В качестве промежуточных продуктов при гидролизе целлюлозы образуются глюкоза и целлобиоза. И весьма удивительно, что если добавить к среде глюкозу (или другие сахара), то они очень плохо усваиваются либо совсем не используются. А если в среде имеются одновременно глюкоза и клетчатка, то сбраживается прежде всего клетчатка. Это свидетельствует о высокой специализации целлюлозоразлагающих анаэробов.

Целлюлозолитические бактерии отличаются не только физиологическими, но и морфологическими особенностями. Большинство целлюлозолитических спорообразующих анаэробов имеют вид очень тонких длинных палочек, образующих споры по плектридиальному типу.

Обычно вегетативные клетки находятся в адсорбированном состоянии на волокнах целлюлозы (рис. 51). Вероятно, это связано с тем, что ферменты, гидролизующие клетчатку (целлюлазы), в среду не выделяются, а прикреплены к поверхности клеток. Под микроскопом можно увидеть, что разрушаются те участки клетчатки, к которым клетки непосредственно прикасаются. Спорообразующие клетки обычно находятся в растворе, так как при спорообразовании изменяется характер связи со средой, а спорообразование идет за счет эндогенного метаболизма (за счет внутриклеточных запасов питательных веществ).

Первая культура анаэробных спорообразующих бактерий, способная осуществлять брожение целлюлозы, была выделена В. Л. Омелянским. В литературе описано 12 видов целлюлозолитических анаэробов. Спорообразующие целлюлозолитические анаэробы до настоящего времени очень плохо изучены в связи с трудностями их выделения и культивирования. Большинство выделенных штаммов были загрязнены посторонними бактериями, что значительно обесценивает данные по физиологии и биохимии этих организмов.

Брожение органических кислот и спиртов. Выделено несколько специализированных видов анаэробных бактерий (возможно, их в природе существует намного больше), использующих органические кислоты и спирты в качестве источника углерода и энергии.

Так, Cl. kluyveri получает энергию путем сопряженного окисления-восстановления системы этиловый спирт — уксусная кислота. В результате реакции образуются высшие жирные кислоты (главным образом капроновая и масляная кислоты). Характерно, что Cl. kluyveri не способен сбраживать углеводы, аминокислоты и пурины. Накопление энергии в форме АТФ происходит у этого анаэроба с использованием механизмов окислительного фосфорилирования. Cl. lactoacetophilum осуществляет брожение сходного типа, сбраживая смесь лактата и уксусной кислоты. Обе эти бактерии используют в качестве акцепторов водорода уксусную кислоту, а в качестве доноров первая — этанол, вторая — лактат.

Cl. glycollicum превращает этиленгликоль в смесь этилового спирта и уксусной кислоты:


CH2(OH) CH2(OH) → CH3COOH+CH3CH2OH +H2O
этиленгликоль → уксусная кислота + этиловый спирт


Анаэробная бактерия из рода Clostridium (не определенная до вида) осуществляет крайне интересный тип брожения соединений с сульфониевой связью. Такие вещества могут рассматриваться как соединения, обладающие макроэргической связью, при разрыве которой выделяется большое количество энергии. Clostridium species (Штадтман, 1968) сбраживает диметилпропиотетин, используя его в качестве единственного источника углерода и энергии:


3(CH3)2S+—CH2CH2COO + 2H2O → 2CH3CH2COO + CH3COO + 3(CH3)2S + CO2 + H+
диметилпропиотетин → пропионовая кислота + уксусная кислота + диметилсульфид


[править] Протеолитические анаэробные бактерии

Протеолитические анаэробные бактерии —очень большая группа анаэробов, получающая энергию за счет анаэробного разрушения аминокислот. Многие из них являются строго протеолитическими организмами, неспособными сбраживать углеводы. Другие обладают слабовыраженной сахаролитической активностью. Имеются также активные протеолитические виды, способные осуществлять маслянокислое брожение Сахаров. Протеолитическая активность у некоторых анаэробов (Cl. histolyticum) настолько высока, что у зараженных этими микроорганизмами животных наблюдается как бы расплавление мышц, после чего остаются голые кости. Освобождающиеся после протеолиза (разрушение белков протеолитическими ферментами) аминокислоты могут сбраживаться двумя путями. Cl. sporogenes, например, сбраживает пару аминокислот, причем одна из них окисляется, а другая восстанавливается (реакция Стикленда), т. е. одна аминокислота служит донором, а другая — акцептором водорода:


аланин + 2 глицин + 2H2O → 3 уксусная кислота + CO2+3NH3


Существуют виды протеолитических анаэробов, которые могут сбраживать и по одной аминокислоте, например глутаминовую кислоту (Cl. tetani).


[править] Пуринолитические анаэробы

Существуют три вида бактерий, сбраживающих гетероциклические соединения с азотным кольцом: С1. acidiurici, Cl. cylindrosporum и Cl. uracilicum. Они способны разрушать пурины и пиримидины с образованием уксусной кислоты, углекислого газа и аммиака. Первые два вида не способны использовать ни углеводы, ни белки (аминокислоты). Ими быстро расщепляются ксантин, гуанин, гуанозин, 6,8-диоксипурин; более медленно и после адаптации (приспособления) разрушаются гипоксантин и инозин. Cl. acidiurici и Cl. cylindrosporum физиологически очень близки, но четко разделяются по морфологическим признакам. У Cl. acidiurici споры имеют овальную форму и расположены терминально. Клетки при спорообразовании раздуваются. У Cl. cylindrosporum споры цилиндрические, расположены центрально или субтерминально. Спорангии при этом не раздуваются.


[править] Сульфатредуцирующие бактерии

Восстановление микроорганизмами полностью или частично окисленных соединений минеральной серы в анаэробных условиях за счет окисления органического вещества или водорода называют микробной сульфатредукцией. Этот процесс был открыт русским химиком Н. Д. Зелинским в 1890-1893 гг. Чистая культура сульфатредуцирующих бактерий была выделена Бейеринком в 1895 г. Сначала бактерий, восстанавливающих сульфаты, относили к неспороносным. Затем было замечено, что в культурах сульфатредуцирующих бактерий иногда появляются споры (когда инкубирование проводилось при высоких температурах). В настоящее время выяснилось, что большинство неспорообразующих штаммов, выделенных из различных субстратов, было загрязнено спорообразующими. Последние выделены в новый род Desulfotomaculum, в который входят четыре вида: D. nigrificans, D. ruminis, D. orientis, D. antarcticum. Первые два вида используют некоторые органические кислоты (молочную, пировиноградную), но не усваивают углеводы (глюкозу). D. antarcticum способен усваивать глюкозу. D. nigrificans — термофил, оптимальная температура для роста этого вида 55° С. Восстановление сульфатов происходит по уравнению:


2CH3—CHOH—COOH + Na2SO4 → 2CH3—COOH + 2CO2 + H2S + NaOH
молочная кислота + сульфат натрия → уксусная кислота


Таким образом, у анаэробных спорообразующих бактерий мы встречаемся с удивительным физиологическим разнообразием как по механизмам анаэробного получения энергии, так и по диапазону используемых субстратов.

Имеется группа анаэробов, использующих главным образом углеводы; другая группа разлагает преимущественно белки и аминокислоты; третья — сбраживает только пурины; четвертая — получает энергию за счет окисления органических кислот или водорода, используя в качестве акцептора водорода сульфаты.

Специфичность по отношению к субстратам у спорообразующих анаэробов выражена резко. Потребности в питательных веществах у этих групп весьма различны. Некоторые протеолитические анаэробы (например, Cl. sporogens) не удовлетворяются средами, содержащими полный набор аминокислот, углеводы, минеральные соли, комплекс витаминов, активаторы микробного роста. Такие резко выраженные гетеротрофы растут лишь на средах, содержащих белки или продукты их частичного гидролиза. С другой стороны, существуют анаэробы, развивающиеся на очень простых средах, в состав которых входит несколько минеральных солей, в том числе сульфаты и органическая кислота либо водород в качестве донора электронов (сульфатредуцирующие бактерии). При этом может усваиваться атмосферный азот.

Способность фиксировать молекулярный азот широко распространена среди спороносных бактерий. Этот процесс могут осуществлять маслянокислые, ацетонобутиловые и сульфатредуцирующие бактерии. Наиболее активные азотфиксаторы — сахаролитические анаэробы (клостридии).

Отношение к кислороду не одинаковое у различных физиологических групп спорообразующих анаэробов. Более устойчивыми к действию кислорода являются сахаролитические анаэробы. Часть представителей этой группы — аэротолерантные формы (способные давать слабый рост на пластинках агара даже в аэробных условиях), например Cl. carnis, Cl. histolyticum и др. Очень чувствительны к кислороду и трудно культивируются сульфатредуцирующие бактерии. Они могут развиваться только в строго анаэробных условиях при тщательном удалении кислорода из сред, в которых они культивируются.


[править] Распространение и роль в природе спорообразующих анаэробных бактерий

Распространение и роль в природе спорообразующих анаэробных бактерий

Анаэробные спорообразующие бактерии широко распространены в природе. Их находили в самых различных почвах всех континентов, на скальных породах горных массивов, в морях, пресных водах озер и рек, водах глубинных нефтяных источников, в кишечнике человека и животных и т. д.

В определителе А. Р. Прево дано описание около 200 видов анаэробных спорообразующих бактерий. На самом деле их в природе гораздо больше. Общепризнанным является мнение, что только меньшая доля микроорганизмов известна в настоящее время. Особенно это касается анаэробов, которые с большим трудом выделяются из природных субстратов и культивируются в лабораториях. И не случайно с каждым годом мы узнаем о новых микроорганизмах, выделенных «охотниками» за микробами.

С открытием новых, особенно своеобразных, видов и групп микроорганизмов становятся известными новые биохимические процессы, осуществляемые микроорганизмами в природе, новые метаболиты микроорганизмов (ферменты, гормоны, витамины, антибиотики и т. д.), не говоря уже о том, что расширяются наши представления о разнообразии форм микроорганизмов и органического мира в целом.

Благодаря очень интенсивному обмену веществ, а следовательно, и необычайно высокой химической активности, микроорганизмы играют огромную роль в круговороте веществ на Земле. Анаэробные микроорганизмы принимают активное участие во многих звеньях этого круговорота, что обусловлено разнообразием и сложностью процессов их обмена веществ, большим набором органических и неорганических веществ, трансформируемых этими микроорганизмами, и крайне широким спектром выделяемых продуктов метаболизма. Во всех биологических циклах (круговороте углерода, азота, серы, фосфора и других элементов) анаэробам принадлежит весьма существенная роль.

Сахаролитические спороносные анаэробы «специализируются» на разложении углеводов и родственных им соединений, попадающих в почву и другие среды благодаря деятельности фотосинтезирующих организмов.

Другие физиологические группы анаэробов участвуют в круговороте азотсодержащих веществ: разлагают белки, аминокислоты, пурины (протеолитические, пуринолитические бактерии). Многие же способны активно фиксировать атмосферный азот, переводя его в органическую форму. Эти анаэробы способствуют повышению плодородия почв. Количество клеток протеолитических и сахаролитических анаэробов в 1 г плодородных почв достигает даже миллионов. Особое значение имеют те группы микроорганизмов, которые участвуют в разложении труднодоступных форм органических соединений, таких, как пектиновые вещества и целлюлоза. Именно эти вещества составляют большую долю растительных остатков и являются главным источником углерода для почвенных микроорганизмов. В анаэробных условиях эти соединения разрушаются пектинолитическими и целлюлозолитическими анаэробами.

Деятельность сульфатредуцирующих бактерий очень многогранна. С ними связывают образование нефти, сероводорода в морях, почвах, лечебных грязях. Еще в 1890 г. Н. Д. Зелинский и Е. Брусиловский показали, что слой воды в Черном море, насыщенный сероводородом, является результатом активности сульфатредуцирующих анаэробных бактерий. В почвах деятельность сульфатредуцирующих бактерий приводит к содообразованию. В определенных условиях, благоприятствующих накоплению соды, может произойти содовое засоление почвы. Массовое развитие сульфатредуцирующих бактерий, например, в почвах рисовых плантаций приводит к усилению восстановительных процессов, переводящих многие питательные вещества в доступную для корней риса форму.

Образование сероводорода сульфатредуцирующими бактериями часто приносит вред, вызывая при определенных обстоятельствах коррозию металлических подводных и подземных сооружений.

Патогенные и токсигенные спорообразующие анаэробы. Некоторые из протеолитических и сахаролитических бактерий могут быть возбудителями болезней, особенно таких, как гангрена и столбняк (так называемые раневые инфекции). Возбудителями газовой гангрены являются такие виды анаэробных спороносных бактерий, как Cl. perfringens, Cl. histolyticum, Cl. septicum, Cl. oedematiens, Cl. bifermentans. Возбудитель столбняка — Cl. tetani. Хотя патогенные бактерии не так часто встречаются в медицинской практике, как другие патогенные микроорганизмы, но вызываемые ими заболевания очень опасны, протекают быстро и часто с фатальным исходом.

Попадая в рану, гангренозные формы анаэробов вызывают быстро распространяющееся разрушение мышечной ткани, сопровождающееся накоплением в ткани водорода. Возбудители вырабатывают сильнодействующие экзотоксины. Наиболее изучен альфа-токсин, выделяемый Cl. perfringens. Это фермент лецитиназа, разрушающая лецитин (важный компонент клеточных мембран). Лецитиназа также лизирует и красные кровяные тельца. Cl. tetani при развитии в ранах продуцирует белковый токсин большой силы, который через кровь и нервные каналы быстро проникает в организм и вызывает повреждение центральной нервной системы .

Cl. botulinum продуцирует токсины, вызывающие опасные, часто фатальные пищевые отравления. Насчитывается 5 разновидностей Cl. botulinum, синтезирующих 6 различных токсинов. Из них наибольшей токсичностью обладает токсин типа Д, 1 мг. которого содержит около 1012 минимальных летальных доз для мышей; 5-10 мг этого токсина способны убить все население земного шара. Это наиболее сильный из всех токсинов, которые способны вырабатывать живые организмы. При пищевых отравлениях чаще всего встречается токсин типа А. Несмотря на большую молекулярную массу (~1 000 000), токсин легко проникает через стенку кишечника в кровь. Смерть обычно наступает в результате остановки дыхания. Токсин очень устойчив к действию протеолитических ферментов кишечного тракта, но термолабилен и может разрушаться при кипячении.


[править] Использование анаэробов в промышленности

Использование анаэробов в промышленности

Получение ацетона и бутанола с помощью микроорганизмов было первым крупнотоннажным производством, где нашли применение анаэробные спорообразующие бактерии. В качестве продуцента ацетона и бутанола использовался Clostridium acetobutylicum, вызывающий адетонобутиловое брожение углеводов.

Ацетон и бутанол — ценное сырье для производства взрывчатых веществ и каучука. Бутиловый спирт — один из лучших растворителей целлюлозных лаков. Особенно широко начал применяться микробиологический способ получения растворителей в конце 40-х годов.

В последние годы расширяется использование микроорганизмов как в нашей стране, так и за рубежом для промышленного производства таких ценных веществ, как антибиотики, ферменты, аминокислоты, гормоны, витамины, белкововитаминные препараты.

Дальнейший прогресс микробиологической промышленности связан с поисками и внедрением новых перспективных продуцентов веществ, необходимых для народного хозяйства. В этом отношении экономически выгодно может быть применение анаэробных микроорганизмов, в частности спорообразующих анаэробов, которые, как известно, являются активными продуцентами ряда важных ферментов: пектиназ, целлюлаз, протеаз, липаз, амилаз, декарбоксилазы и гиалуронидазы. Анаэробы в некоторых странах уже используются для трансформации стероидных гормонов, а также для получения липазы, коллагеназы и пектаз. Так как при выращивании анаэробов воздух (кислород) в ферментеры подавать не нужно, производственный процесс облегчается, а стоимость продуктов ферментации значительно удешевляется по сравнению с аналогичными аэробными процессами.

В последнее время показано, что споры некоторых видов анаэробов при внутривенном введении животным проявляют онколитическую активность (наблюдается разрушение злокачественных образований). Споры анаэробов обладают также радиопротекторной активностью и при внутривенном введении животным способны повышать выживаемость и среднюю продолжительность жизни животных, облученных смертельной дозой радиации. Очевидно,споры анаэробов можно использовать для получения онколитических и радиопротекторных веществ .

Спороносные анаэробные бактерии применяются при мочке льна, конопли и других лубоволокнистых растений. Под влиянием микробных ферментов (пектиназ) расщепляются пектиновые вещества, склеивающие паренхимные клетки и лубяные пучки между собой. Этот процесс используется для получения волокна, необходимого для текстильной промышленности. До сих пор в промышленных условиях мочку льна осуществляют без регулирования состава пектинолитических микроорганизмов. В то же время применение в виде заквасок чистых культур анаэробов (активных пектинолитических клостридиев) сокращает процесс в 3-4 раза и позволяет получать волокно высокого качества. Применение специальных препаратов позволит в будущем, кроме того, стандартизовать процесс получения льняного волокна.

Пектинолитические ферменты анаэробов имеют в этом отношении преимущество по сравнению с ферментами грибов, которые содержат примеси целлюлаз, ухудшающих качество волокна.

Дальнейшее всестороннее изучение обширного мира анаэробных бактерий не только приведет ко многим важным открытиям теоретического характера, но и будет способствовать широкому практическому использованию деятельности анаэробных микроорганизмов в народном хозяйстве.


[править] Систематика спорообразующих анаэробных бактерий

В настоящее время имеются три наиболее известные системы классификации анаэробов: Н. А. Красильникова (1949), Берги (1957) и Прево (1957, 1967). По Красильникову, все спорообразующие бактерии объединяются в семейство Bacillaceae. Это семейство имеет два рода — Bacillus и Clostridium. В род Bacillus входят как аэробные, так и анаэробные бактерии (последние составляют Х-группу), которые не образуют гранулезы и не раздуваются (либо слабо раздуваются) при спорообразовании. Род Clostridium объединяет бактерии, клетки которых в процессе спорообразования раздуваются с приобретением клостридиальной (лимоновидной) формы и накапливают гранулезу.


Рис. 64. Сульфатредуцирующая спороносная бактерия. Клетки при спорообразовании раздуваются. Увел. ×2700.

За прошедшие 20 лет после издания определителя Красильникова накопилось много данных об анаэробных микроорганизмах, их видовом разнообразии, биохимии, физиологии и цитологии. Были обнаружены новые физиологические группы, относящиеся к разным родам, и выделено много новых видов спорообразующих анаэробов.

Определитель Прево, Турпина и Кайзера наиболее полно описывает анаэробные микроорганизмы, известные в настоящее время микробиологам. Около 200 видов спорообразующих анаэробных бактерий распределяются в нем по трем порядкам: Clostridiales, Plectridiales и Sporovibrionales (схема 3 на табл. 36).

Морфологические различия между вегетативными клетками различных видов очень незначительны, а спорулирующие клетки и сами споры необычайно разнообразны. Это явление имеет очень большое значение для разделения анаэробов на систематические группы.

Для разделения на порядки служит форма вегетативных клеток (прямые или изогнутые палочки) и расположение спор в спорангиях (центральное, субтерминальное и терминальное). При разделении на семейства и роды принимаются во внимание грамокраска, подвижность клеток, способность образовывать капсулу. Различные сочетания этих признаков позволили разделить все спорообразующие анаэробные бактерии на 5 семейств и 10 родов.

Порядок Clostridiales. К нему относятся подвижные и неподвижные грамположительные и грамотрицательные палочки, раздувающиеся при спорообразовании. Споры расположены центрально и субтерминально. Имеются пигментированные виды. В основном анаэробные, но возможны факультативные формы. В порядок входят два семейства.

Семейство Endosporaceae включает грамотрицательные клостридии; споры расположены центрально или субтерминально. В этом семействе два рода: Endosporus — подвижные формы и Paraplectrum — неподвижные, образуют капсулу. Семейство Clostridiaceae включает грамположительные клостридии. Споры центральные или субтерминальные. Подразделяется на три рода: Inflabilis — неподвижные формы, Welchia — неподвижные капсулированные палочки, Clostridium — подвижные формы.

Порядок Plectridiales. Подвижные и неподвижные, грамположительные и грамотрицательные палочки. Споры образуются терминально. Порядок подразделяется на два семейства.

Семейство Terminosporaceae — грамотрицательные плектридии. Семейство состоит из двух родов: Terminosporus — подвижные и Caduceus — неподвижные формы.

Семейство Plectridiaceae — грамположительные плектридии. В этом семействе два рода: Plectridium — подвижные и Acuformis — неподвижные организмы.

Порядок Sporovibrionales включает спорообразующие подвижные анаэробные бактерии с изогнутыми (вибрионоподобными) грамотрицательными клетками. Большинство из них способно восстанавливать сульфаты и нитраты.

В этом порядке одно семейство — Sporovibrionaceae. В него входит один род — Sporovibrio, объединяющий четыре вида спорообразующих анаэробов. Один из этих видов — Sporovibrio ferrooxydans — не восстанавливает сульфатов, а железо окисляет в гидрат железа.

По Кэмпбеллу и Постгейту, все спорообразующие анаэробы, обладающие постоянной способностью восстанавливать сульфаты, были выделены в новый род — Desulfotomaculum. В него входят облигатные анаэробы с грамотрицательными, прямыми или изогнутыми палочками, раздувающимися у термофильных форм. Споры формируются терминально или субтерминально. Бактерии подвижные, жгутикование перитрихиальное, восстанавливают сульфаты до сульфидов. Обладают цитохромами (класс протогеминов). Состав ДНК колеблется в пределах 41,7-49,2 мол.% Г+Ц. Неспоровые сульфатредуцирующие бактерии из рода Desulfovibrio четко отличаются от спорообразующих по проценту Г+Ц в ДНК, наличию пигмента десульфовиридина и цитохрома, монотрихиальным жгутикованием и отсутствием спорообразования.

Род Desulfotomaculum включает четыре вида. D. nigrificans — типовой вид. Споры овоидные, субтерминальные. Бактерии могут расти без сульфатов на среде с пируватом. Глюкозу и другие углеводы не используют, термофильные. Температурный оптимум 55° С. Процент Г + Ц в ДНК 49,2.

D. ruminis. Споры овоидные, терминальные или субтерминальные. Бактерии способны расти без сульфатов на среде с пируватом. Глюкозу и другие углеводы не сбраживают, мезофилы, Г + Ц в ДНК — 49,2%.

D. orientis. Споры круглые, могут располагаться в клетках центрально, эксцентрально и терминально. Глюкозу и другие углеводы бактерии не сбраживают, не растут на средах с пируватом без сульфатов, мезофилы. Процент Г + Ц в ДНК 45,1.

Японские авторы описали еще один вид спорообразующих сульфатредуцирующих бактерий — D. antarcticum. Споры этих бактерий овоидные, располагаются в клетках центрально или терминально. Нуклеотидный состав ДНК неизвестен. Этот вид отличается от других видов рода Desulfotomaculum способностью использовать глюкозу и разжижать желатин.







Личные инструменты


Инструменты




molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---


molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов     Rambler's Top100 Rambler