Third generation sequencing

Материал из Zbio

Перейти к: навигация, поиск
problems/questions

 Problem list:



Mol.biology // Next-generation sequencing

;



http://molbiol.ru/forums/index.php?showtopic=379998&view=findpost&p=1005887 В конце января в наш институт (MPI MG) приезжал Dr. Stephen Turner, основатель и руководитель компании Pacific Biosciences, и рассказывал о планах компании на ближайшее время.

Pacific Biosciences разрабатывает сиквенатор третьего поколения и является наиболее успешной компанией в этой области. Примерно год назад компания опубликовала статью в Science c описанием реального одномолекулярного сиквенса по своей технологии (см. ниже).

Компания обещает выставить сиквенатор на рынок к концу этого года.

Ожидаемые цены: SMRT-сиквенатор (Single Molecule Real Time) ~$600 000. Кит (реактивы и ZMWs-чип) ~$100 за комплект.

Один ZMWs-чип имеет 80 000 ZMWs-ячеек. Примерно треть отверстий - рабочие (в остальных - либо нет полимеразы, либо, наоборот, слишком много).

Скорость чтения: ~1-3 нуклеотида в секунду в каждой ZMWs-ячейке.

Cредняя длина чтения: 1kb (длина чтения убывает экспоненциально, встречаются ячейки с длиной до ~10kb). Т.е. с одного чипа снимается ~27Mb.

Точность чтения (исходные данные без биоинформатической обработки) - более 90%. Это примерно соответствует точности первой Solexa (Illumina) машины. Ошибки сиквенса почти независимы -- это позволяет повышать точность сиквенса читая один и тот же фрагмент несколько раз.

SMRT-сиквенатор без изменения железа может работать до скорости ~15 нуклеотидов в секунду. С ограниченным апгрейдом (более быстрая камера) - до 50 nt/sec. Изображения не хранятся, хранятся тоько "хромотограммы" похожие на результат работы автоматического сиквенатора первого поколения. Предполагается, что в будущем и хромотограммы хранить не будут. Т.е., на выходе будет только нуклеотидная последовательность с показателями "качества" для каждого нуклеотида.

Сиквенс идёт на индивидуальных (не амплифицированных) молекулах. В частности, это позволяет довольно быстро готовить сиквенсовые библиотеки: несколько часов от образца ДНК до начала сиквенса. В сочетании со сравнительно быстрой сиквенсовой реакцией (~1-3 нуклеотида в секунду в реальном времени) может получится получается хороший медицинский экспресс-анализ.

Все очень интересно и перспективно, НО(!), пока что ожидается, что цена сиквенса будет примерно на порядок выше, чем у Illumina и SOLID (но и на порядок ниже, чем у 454-платформы; см. http://seq.molbiol.ru/ ). С другой строны - это первая машина. К тому же и у технологии в целом и у машины в частности есть большие резервы для повышения эффективности.


umnik.gif

Забавно сравнить технологии компаний Pacific Biosciences и Helicos. В обоих случаях сиквенс проходит на индивидуальных молекулах. Т.е., чисто формально обе технологии можно отнести к третьему поколению. Цена за нуклеотид у Helicos примерно на уровне Illumina/SOLID, а у Pacific Biosciences существенно выше. Казалось бы, это должно означать, что дела у Helicos идут лучше.

На самом деле всё не так. Кроме сомнительного преимущества "сиквенса на отдельных молекулах" Helicos не может предложить ничего, что делало бы технологию лучше, чем уже есть у Illumina (а длина сиквенса у Helicos существенно меньше, чем у Illumina). Язык не поворачивается относить технологию к следующему поколению и непонятно, где найдёт применение машина Heliscop.

Технология Pacific Biosciences хоть и дорога, но даёт столько новых возможностей, что нет никаких сомнений, что это новое поколение сиквенаторов. И хотя машины на рынке ещё нет, многие её уже очень хотят wink.gif



По теме можно псмотреть следующие вещи:

   * в комменариях к этому сообщению находятся (i) описание SMRT-технологии и (ii) список её достоинств и возможных применений;
   * web-сайт Pacific Biosciences http://www.pacificbiosciences.com/
   * описание технологии на сайте компании (pdf-файл и видео-ролик)


Технология

В отличии от других net-generation сиквенаторов, Pacific Biosciences не прокачивает через чип никаких растворов. В собранном чипе сиквенс начинается сам собой и нужно лишь наблюдать за ним. Автоматический флуоресцентный микроскоп в "реальном времени" наблюдает за индивидуальными молекулами полимеразы и детектирует включение флуоресцентно-меченных нуклеотидов.


Ключевые моменты технологии

ZMWs-ячейки Чтобы следить за индивидуальными молекулами ДНК полимеразы используется специальный чип. Одна его сторона -- это стекло, покрытое изнутри металлической фольгой. В фольге проделаны отверстия диаметром несколько десятков нанометров. Так как размер отверстий существенно меньше длины волны света, то свет сквозь них не проходит (так же, как микроволновое излучение не выходит за покрытую металлическим ситом дверцу бытовой микроволновой печи; там соотношение 2мм отверстие // 20см волны).

Но в самом основании отверстия свет есть. Там создается освещенная область объемом ~10-21 литра. Флуоресцентные молекулы в этой области видимы. картинка: smrt_well.jpgкартинка: smrt_light.jpg


что собственно детектируется? Меченные нуклеотиды заходят в освещенную облясть очень ненадолго (быстро уходят из-за диффузии). Так что в отсутствии полимеразы и матрицы в ZMWs-ячейке регистрируется слабый случайный шум. Однако, когда полимераза встраивает правильный нуклеотид, она захватывает его и довольно долго с ним возится. В результате появляется долгий сигнал определенного цвета. Эти сигналы и регистрируются. картинка: smrt_seq.gif


гамма-меченные нуклеотиды Обычно флюоресцентная метка прикрепляются к основаниям ДНК. В SMRT-технологии флуоресцентная группа крепится к гамма-фосфату. При синтезе она отщепляется вместе с пирофосфатом, так что в результате получается нормальная ДНК. Два преимущества гамма-меченных нуклеотидов:

   * в результате синтеза получается нормальная двухцепочечная ДНК, так что синтез может идти долго; гамма-меченные нуклеотиды используются полимеразой даже лучше, чем обычные, так что небольшие примеси немеченных нуклеотидов не приводят к непропорционально большому загрязнению (для меченных за основание нуклеотидов ситуация обратная).

картинка: smrt_nucl.gif


SMRT-сиквенатор По сути дела это комбинация ZMWs-чипа и флуоресцентного микроскопа, которая позволяет регистрировать сиквенс в тысячах ZMWs-ячеек одновременно. картинка: smrt.gif

Картинки: smrt.gif — (70.6к) Изменить Удалить прикреплённый файл smrt_well.jpg — (31.63к) Изменить Удалить прикреплённый файл smrt_light.jpg — (41.44к) Изменить Удалить прикреплённый файл smrt_nucl.gif — (27.01к) Изменить Удалить прикреплённый файл smrt_seq.gif — (59.82к) Изменить Удалить прикреплённый файл Участник онлайн! Redactor admin. Берлин, Германия Фолы*: Снять замечаниеПредупреждений нетДобавить замечание


прочитанное сообщение 05.02.2010 15:24     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес  ICQ

Удалить сообщение Редактировать сообщение Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей IP: 141.14.220.211 | URL #3 множественное цитирование Резервы

  • скорость чтения: сейчас скорость полимеразы искуственно занижена, в принципе, фаговые полимеразы могут достигать скорости ~100 нуклеотидов в секунду. Мультиферментные полимеразные комплексы достигают скоростей ~1000 нуклеотидов в секунду. Технически максимальная допустимая скорость определяется скоростью работы камеры.
  • количество ZMWs-ячеек в чипе. Сейчас чип -- примерно 300х300 ячеек. Принципиальный лимитирующий фактор -- пикселей в камере должно быть достаточно для разрешения "хромотограм". Похоже, что количество ячеек будет увеличено в несколько раз даже без замены камеры.
  • процент занятых ячеек. Уже сейчас ведется работа по повышению доли "полезных ячеек".
  • патентная ситуация. Есть несколько фирм продвигающих свой сиквенаторы третьего поколения и использующие полимеразу и гамма-меченные нуклеотиды. Скорее всего это означает, что будет несколько сходных платформ, а монополиста не будет.


Перспективы и применения

длинные сиквенсы Сейчас cредняя длина сиквенса соответствует длине сиквенса первого поколения (~1kb). Сиквенс в некоторых ячейках продолжается за 10kb -- на это не способна ни одна другая сиквенсовая технология.


прерывистые сиквенсы Основной фактор, который приводит к остановке сиквенса -- свет (предполагается, что это фотоиндуцируемая свободнорадикальная реакция в полимеразе). Если свет выключить, сиквенс будет продолжаться существенно дольше. Это можно использовать для организации некого подобия paired-end сиквенса. Можно выключить свет и позволить сиквенсу идти "втемную". Потом свет на время включается -- записвается сиквенс -- опять выключается и т.д.

Результат -- разнесенные на примерно известное расстояние (± корень из длины последовательности) просиквенированные участки (Strobe Sequencing). Сейчас такие структуры занимают более 50kb. Очень удобно и полезно для сиквенса de novo.


картинка: smrt_templ.gifмногократное чтение одной молекулы Топологически ДНК-матрица для SMRT-сиквенса -- это кольцевая ДНК. Если длина молекулы меньше длины сиквенса, то матрица будет читаться раз за разом по кругу. Это позволяет прочитать одну и ту же матрицу несколько раз и повысить точность сиквенса.


экспресс-анализ Сиквенс идет на индивидуальных (не амплифицированных) молекулах. Это позволяет довольно быстро готовить сиквенсовые библиотеки: несколько часов от образца ДНК до начала сиквенса. В сочетании со сравнительно быстрой сиквенсовой реакцией (~1-3 нуклеотида в секунду в реальном времени) может получится получается хороший медицинский экспресс-анализ.


легкое масштабирование Есть надежда, что будут доступны чипы разных размеров (по разной цене). Это позволит использовать разный масштаб сиквенса для разных проектов. Как вариант сейчас -- разное количество чипов на проект.


эпигенетический анализ Технология позволяет анализировать метилирование по кинетике чтения метилированного участка (в ~60 нуклеотидной окресности модифицированного нуклеотида меняется кинетика чтения). На искуственных матрицах можно различаить метил-цитозин и гидроксиметил-цитозин.


обратная транскрипция Ведутся работы по сиквенсу обратной транскриптазой. Пока что результаты не ахти, но Стив сказал, что ДНК-сиквенсы вначале выглядели так же.

Картинки:



Личные инструменты


Инструменты




molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---


molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов     Rambler's Top100 Rambler